田博雅，馬億珈，奚夢瑤，路 暢，楊 陽，蔡春波，趙 燕，高鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 030801）

腸道微生物是指動(dòng)物腸道中存在的數(shù)量龐大，種類繁多，功能多樣的微生物，其有利于維持宿主腸道微生態(tài)平衡，在營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收中起著關(guān)鍵作用[1-2]。它們大部分與機(jī)體細(xì)胞密切接觸，交換能量物質(zhì)，傳遞信息。Filippo等人的研究發(fā)現(xiàn)宿主飲食習(xí)慣會(huì)對腸道微生物菌群的組成產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[3]。左斌等人在探討影響仔豬腸道微生物早期定植的因素的研究中發(fā)現(xiàn)，仔豬生命早期建立良好的腸道菌群不僅有利于仔豬前期的健康生長，而且對后期的生長育肥也具有重要影響[4]。這些年來，越來越多的研究表明腸道菌群與宿主健康之間存在密切聯(lián)系。顏桂花等人的研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加可溶性玉米纖維可以改變仔豬盲腸內(nèi)微生物多樣性，從而提高盲腸內(nèi)有機(jī)酸濃度，降低腸道滲透性，改善仔豬腸道健康[5]。丁酸梭菌作為一種新型的抗生素替代品，可以促進(jìn)仔豬腸道的生長發(fā)育和消化吸收，提高腸道中有益菌群的數(shù)量和腸道的屏障功能[6,7]。

仔豬腸道健康對于自身后期生產(chǎn)性能的發(fā)揮至關(guān)重要。本試驗(yàn)以山西省地方優(yōu)勢豬種馬身豬、大白豬、山西黑豬和晉汾白豬為研究對象，采用16s測序技術(shù)對仔豬階段盲腸微生物多樣性進(jìn)行檢測，分析不同豬品種盲腸微生物特性，擬探尋仔豬保育期盲腸微生物的變化規(guī)律，為仔豬保育提供理論參考。

1 材料與分析

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

按照行業(yè)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)一將試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于大同市（中國山西?。┓N豬場，試驗(yàn)動(dòng)物組建時(shí)選擇日齡一致，體重相近的馬身豬、山西黑豬、大白豬和晉汾白豬四個(gè)品種的仔豬進(jìn)行試驗(yàn)。在仔豬斷奶末期（28d）和保育末期（70d）進(jìn)行屠宰，每個(gè)品種仔豬各取3頭，屠宰前禁食8h，但可自由飲水，采集盲腸段的內(nèi)容物置于凍存管于液氮中保存，每個(gè)采樣點(diǎn)的樣品隨機(jī)抽取3份進(jìn)性16S rRNA測序分析。

1.2 樣本DNA抽提與16S rRNA測序

腸道內(nèi)容物DNA的提取采用北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品DNA提取試劑盒進(jìn)行，并檢測其DNA純度，濃度及質(zhì)量。根據(jù)細(xì)菌V 3-V 4可變區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列：341 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806 R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變形3 min；27個(gè)循環(huán)（95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s）；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測。樣品在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Miseq PE 300平臺(tái)進(jìn)行檢測。序列數(shù)據(jù)根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，采用Trimmomatic軟件對拼接質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾及數(shù)據(jù)優(yōu)化。

1.3 OTU菌群聚類分析

對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，便于降低分析中間過程冗余計(jì)算量，然后去除沒有重復(fù)的單序列，而后再按照97%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，最后對所得OTU進(jìn)行不同分類學(xué)水平的注釋，生成OTU分析結(jié)果。使用97%相似度的OTU，利用Mothur做Rarefaction分析，利用R Studio（v.3.0.2）工具制作Shannon和Chao指數(shù)上的稀釋曲線圖。

1.4 菌群多樣性分析

利用R語言工具做出不同分組在門和屬水平上的群落豐度組成圖（群落Bar圖）。采用Mothur（v.1.34.0）軟件進(jìn)行菌群Alpha多樣性分析，計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下微生物群落的多樣性和豐富度，分別選擇Sobs指數(shù)，Heip指數(shù)指數(shù)和Simpson指數(shù)進(jìn)行分析。采用PCoA分析（Principal co-ordinates analysis），即主坐標(biāo)分析，用來研究樣本群落組成的相似性或差異性。利用R語言對一系列特征值和特征向量進(jìn)行排序，然后選擇排在前幾位的最主要特征值，最后將其表現(xiàn)在坐標(biāo)系里。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel軟件對OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行基礎(chǔ)分析處理，同一品種不同日齡間采用T檢驗(yàn)分析，不同品種同一日齡間采用單因素方差分析，選用SSR法進(jìn)行組間比較，0.05和0.01為顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 OTU聚類分析

16S rRNA測序結(jié)果經(jīng)過濾質(zhì)控之后獲得了648216條序列，共獲得888個(gè)OTU，每個(gè)樣品平均獲得393個(gè)OTU。

2.2 稀釋曲線分析

利用Mothur做Rarefaction分析后得到稀釋曲線，圖 1中分別呈現(xiàn)了Shannon和Chao指數(shù)稀釋曲線，可見稀釋曲線均達(dá)到了平臺(tái)期，包含了樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性的樣本信息，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)符合條件。

圖1 稀釋曲線分析結(jié)果

2.3 Alpha多樣性分析

Sobs指數(shù)可以用來描述群落豐富度的實(shí)際觀測值。由Sobs指數(shù)圖（圖 2A）可知，在28日齡時(shí)，大白豬盲腸腸道微生物豐富度最高，馬身豬最低；在70日齡時(shí)，大白豬盲腸腸道微生物豐富度最高，晉汾白豬最低。在整個(gè)保育期，大白豬的盲腸腸道微生物豐富度都是最高的。隨著仔豬生長發(fā)育，大白豬，晉汾白豬和山西黑豬的盲腸腸道微生物豐富度逐漸降低，而馬身豬逐漸升高。

Heip指數(shù)是用來描述Heip群落均勻度的指數(shù)。由Heip指數(shù)圖（圖 2B）可知，在28日齡時(shí)，晉汾白豬盲腸腸道微生物均勻度最差，其他三個(gè)品種較為一致；在70日齡與28日齡相反，大白豬盲腸腸道微生物均勻度最差，山西黑豬和晉汾白豬次之，馬身豬最低。隨著仔豬生長發(fā)育菌群均勻度均發(fā)生顯著變化，馬身豬均勻度升高但變化不顯著，而大白豬變化最大，菌群發(fā)生較大變化。

Simpson指數(shù)是用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中常用來定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。由Simpson指數(shù)圖（圖 2C）可知，在28日齡時(shí)，晉汾白豬盲腸微生物多樣性最高，馬身豬最低；在70日齡時(shí)，馬身豬盲腸微生物多樣性最高，大白豬最低。隨著仔豬生長發(fā)育，大白豬，晉汾白豬和山西黑豬的盲腸微生物多樣性逐漸降低，而馬身豬逐漸升高。

圖2 Sobs指數(shù)圖(A) Heip指數(shù)圖(B) Simpson指數(shù)圖(C)

Alpha多樣性結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Sobs和Simpson指數(shù)的變化趨勢基本一致，大白豬，晉汾白豬和山西黑豬隨著日齡增長逐漸降低，馬身豬逐漸升高。而在Heip指數(shù)中，隨著日齡增長，大白豬，晉汾白豬和馬身豬逐漸降低，山西黑豬逐漸上升。

2.4 Beta多樣性分析

PCoA分析是一種對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的技術(shù)，可以有效的找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，用來研究樣本群落組成的相似性和差異性。基于加權(quán)UniFrac距離進(jìn)行的PCoA分析的結(jié)果，在屬水平分析發(fā)現(xiàn)，大白豬仔豬的盲腸微生物菌群在保育期（28～70日齡）較為集中，而其余品種仔豬的盲腸微生物菌群分布在不同區(qū)域。在相同的日齡上，不同品種樣本都能完全區(qū)分，差異很顯著（圖 3）。在28日齡時(shí)，四個(gè)品種樣本都處于一、三象限；而在70日齡時(shí)，不同品種之間分布比較分散，一、三、四象限都有，差異比較顯著。

圖3 PCoA分析圖

X軸和Y軸表示兩個(gè)選定的主坐標(biāo)軸；X軸和Y軸的刻度是相對距離，無實(shí)際意義；不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同分組的樣本，兩樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成越相似。

2.5 群落組成分析

分類學(xué)分析結(jié)果表明，微生物菌群分布于17個(gè)門（圖4），四個(gè)品種的盲腸腸道微生物優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes），其中70日齡的晉汾白豬和28日齡的馬身豬中微生物群落豐度僅次于厚壁菌門的是變形菌門（Proteobacteria），所占比例分別為32.9%和19.6%；其余分組中微生物群落豐度僅次于厚壁菌門的是擬桿菌門（Bacteroidetes)。隨著日齡增加，大白豬和山西黑豬仔豬盲腸中的厚壁菌門豐度呈逐漸升高的趨勢，而晉汾白豬和馬身豬仔豬盲腸中的厚壁菌門均是呈逐漸降低的趨勢。晉汾白豬仔豬在28日齡時(shí)盲腸中的厚壁菌門所占比重為73.3%，顯著高于（P＜0.05）其他相同日齡的品種。山西黑豬仔豬在28日齡時(shí)盲腸中的厚壁菌門的占比最少，為26.8%，而在70日齡時(shí)，山西黑豬仔豬盲腸中厚壁菌門所占比例顯著高于其他品種，為70.3%，并且擬桿菌門在山西黑豬仔豬保育期所占的比例下降最為迅速，從69.4%降到6.7%。馬身豬仔豬的盲腸中擬桿菌門所占的比例是隨著仔豬的生長發(fā)育逐漸升高，而在大白豬、山西黑豬和晉汾白豬中都是隨著仔豬生長發(fā)育逐漸降低。

圖4 門水平上樣本的群落豐度組成圖

進(jìn)一步分析17個(gè)門中包含的257個(gè)屬（圖 5）。在菌屬水平分析發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae_NK3B31_group）、大腸志賀氏桿菌屬（Escherichia_Sh-igella），狹義梭狀芽孢桿菌屬（Clostrid-ium sensu stricto 1）為所有分組中的優(yōu)勢菌屬，在馬身豬保育期盲腸微生物中這四種菌屬所占比例分別為13.2%，7.1%，9.6%，1.7%；在山西黑豬中所占比例分別為1.6%，4.6%，6.2%，4.0%；在大白豬中所占比例分別為0.9%，16.9%，5.6%，4.1%；在晉汾白豬中所占比列分別為16.8%，1.9%，9.6%，9.3%。馬身豬在28日齡的優(yōu)勢菌屬為大腸志賀氏桿菌屬，在70日齡的優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬；山西黑豬在28日齡的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬（Bacteroiders），在70日齡的優(yōu)勢菌屬為Subdoligranulum；晉汾白豬在28日齡的優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬，在70日齡的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬；大白豬在28日齡和70日齡的優(yōu)勢菌屬都為普雷沃氏菌屬。隨著仔豬生長發(fā)育，在保育前期乳酸菌比例較高，在保育后期普雷沃氏菌屬豐度逐漸升高。

圖5 屬水平上樣本的群落豐度組成圖

3 討論

仔豬的健康生長需要一個(gè)平衡的腸道微生態(tài)環(huán)境。新生仔豬從母體及分娩環(huán)境中獲得胃腸道菌群并以此形成較為穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境。健康的腸道菌群具有促進(jìn)豬的營養(yǎng)代謝，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，抑制病原感染等功能[8,9]。本研究結(jié)果表明，馬身豬、山西黑豬和大白豬在保育期（28～70d）腸道微生物多樣性雖然處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化范圍，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。而晉汾白豬仔豬在保育期的微生物多樣性發(fā)生較大變化（P＜ 0.05），說明不同品種間腸道微生物的發(fā)展與成熟有著顯著的差異。隨著日齡增長，馬身豬的盲腸腸道微生物多樣性逐漸升高但變化范圍不大，山西黑豬、晉汾白豬和大白豬品種不同時(shí)間點(diǎn)豐度范圍變化較大，而且大白豬變化最大，說明我國地方豬品種腸道微生物較為穩(wěn)定，推測可能與馬身豬較高的抗逆性能有關(guān)。

研究表明腸道變形菌門能夠反映微生態(tài)失調(diào)或不穩(wěn)定，在某些腸道環(huán)境下，他們會(huì)成為可引發(fā)炎癥的腸道微生物，動(dòng)物易出現(xiàn)代謝疾病和生殖障礙[10]。本研究發(fā)現(xiàn)70日齡的晉汾白豬腸道內(nèi)變形菌門的數(shù)量顯著上升，而其他品種中變形菌門的豐度并不高，提示應(yīng)該加強(qiáng)對晉汾白豬仔豬保育工作，保證仔豬腸道健康。擬桿菌為革蘭氏陰性菌，是形態(tài)一致或多形態(tài)的專性厭氧桿菌，與其他菌群及宿主之間有著復(fù)雜的聯(lián)系，是條件致病菌，與宿主健康有著緊密的聯(lián)系[11]。

近年來普雷沃氏菌屬獲得了越來越多的關(guān)注，因?yàn)樗軌蚪到鈴V譜的植物多糖[12]，周波蘭等人的研究表明普雷沃氏菌屬豐度升高會(huì)促進(jìn)腸道消化碳水化合物和膳食纖維，從而有利于維持腸道菌群穩(wěn)定，增強(qiáng)免疫功能[13]。普雷沃氏菌屬還可以分解引發(fā)腸道疼痛的黏腸液。而本試驗(yàn)中晉汾白豬在整個(gè)保育期內(nèi)普雷沃氏菌屬的豐度處于較高水平，說明其對碳水化合物的消化能力強(qiáng)。

4 結(jié)論

本研究對馬身豬、山西黑豬、大白豬和晉汾白豬四個(gè)品種的仔豬保育階段腸道微生物多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種仔豬的盲腸微生物多樣性具有一定顯著差異。厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是此階段的優(yōu)勢菌門，乳酸桿菌在保育前期處于較高水平，普雷沃氏菌屬在保育后期豐度逐漸升高。本研究結(jié)果可為探析腸道微生態(tài)對仔豬生長發(fā)育的作用機(jī)制提供參考。