王海娟 鄭雅賓 張靜

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見腫瘤，死亡率位居各種腫瘤中第5位，5年生存率僅為50%，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1]。腫瘤的發(fā)生與癌基因的突變和抑癌基因的失活密切相關(guān)，上調(diào)p21、p27、p57基因表達(dá)，可增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[2]。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)在多種人類癌癥中過表達(dá)[3]，例如CRC組織[4]。Skp2過表達(dá)和p27的低表達(dá)與乳腺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、前列腺癌和CRC的不良預(yù)后密切相關(guān)[5]。在CRC中，Skp2過表達(dá)可負(fù)向影響p27，p27在多種細(xì)胞中具有強(qiáng)大的生長(zhǎng)抑制作用[6]。細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基1(cyclin-dependentprotein kinase regulatory subunit 1，CKS1)基因的表達(dá)惡性腫瘤密切相關(guān)[7]。本研究通過干擾Skp2，觀察其對(duì)CRC細(xì)胞LS513生長(zhǎng)及遷移侵襲能力的影響。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2020年9月～10月我院普外科切除的16例CRC組織及距離其邊緣5 cm的癌旁組織，其中男9例，女7例，年齡40～62歲。術(shù)前均無腫瘤病史、放化療及免疫治療史。所有組織于離體5分鐘內(nèi)置于液氮罐中保存。人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CoN(ATCC CRL-1790TM)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；人CRC細(xì)胞系LS513(目錄號(hào)：TcHu237)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；人CRC細(xì)胞系SW480、HT29和SW620均由上海消化外科研究所贈(zèng)與。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和病人知情同意。

二、方法

1.主要試劑及儀器：BALB/c雌性裸鼠(4-6周齡，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0009)購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Giboc公司；CCK-8試劑盒購自MCE公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；pSUPER-siRNA NC(RNA干擾空載體)、pSUPER-siRNA Skp2(RNA干擾Skp2載體)均由上海生工生物有限公司構(gòu)建；Skp2、p27和GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質(zhì)膠、PVDF膜、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和GAPDH鼠抗均購自美國Sigma公司；ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中山金橋生物科技有限公司；Skp2、p27、p21、p57、CKS1鼠抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司；酶標(biāo)儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司；TL988 qRT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司；轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：分別將各個(gè)細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，放于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.qRT-PCR檢測(cè)Skp2和p27在CRC組織、癌旁組織及不同細(xì)胞系中的表達(dá)：使用RNA提取試劑盒分別提取CRC組織、癌旁組織以及不同細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系：2×SYBR mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5分鐘、95 ℃變性15 s、60 ℃退火50 s、40個(gè)循環(huán)、72 ℃延伸10分鐘。分別以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt算法，計(jì)算Skp2和p27 mRNA表達(dá)水平。Skp2、p27及GAPDH引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：取生長(zhǎng)密度達(dá)50%～60%的LS513細(xì)胞，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染pSUPER-siRNA NC(siRNA NC組)、pSUPER-siRNA Skp2(siRNA Skp2組)，另取未轉(zhuǎn)染LS513細(xì)胞(LS513組)作為對(duì)照，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染或培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

5.CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性：收集轉(zhuǎn)染或培養(yǎng)24小時(shí)后的各組細(xì)胞，每孔100 μl接種至96孔板中，加入濃度為10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)下的OD值，OD值越大表明細(xì)胞增殖活性越高。

6.Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移侵襲能力：取各組細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基，制成濃度為1×108個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl細(xì)胞懸液接種到Transwell小室上室，取600 μl含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基至Transwell小室下室，37 ℃培養(yǎng)24小時(shí)后，下室用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘，PBS洗滌3次，甲醇固定15分鐘，0.1%結(jié)晶紫室溫染色40分鐘。沖洗多余染液、晾干后，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過微孔膜的細(xì)胞。檢測(cè)侵襲能力時(shí)，需在Transwell小室上室鋪50 μl普通Matrigel膠工作液(Matrigel膠∶培養(yǎng)基=1∶8)，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜，待Matrigel膠凝固后，其余步驟與細(xì)胞遷移能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)相同。穿膜細(xì)胞數(shù)越多表明細(xì)胞遷移或侵襲能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

7.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力：參考唐丹等[8]所用方法收集培養(yǎng)24小時(shí)后的各組細(xì)胞，使用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，取100 μl分別皮下接種于裸鼠右前肢腋下，觀察腫瘤形成情況并于第20天時(shí)使裸鼠吸入過量乙醚后實(shí)施安樂死，仔細(xì)分離瘤體并稱重。瘤體越重表明細(xì)胞成瘤能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

8.Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中Skp2、p27、p21、p57、CKS1蛋白表達(dá)水平：收集置于液氮中的不同組織及培養(yǎng)24小時(shí)后的各組細(xì)胞，采用蛋白抽提試劑盒提取不同組織和細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，依次進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、抗體封閉、1∶1 000濃度稀釋后的p27、p21、p57、CKS1鼠抗4 ℃過夜孵育、TBST緩沖液洗膜，然后置于含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶2 000)中室溫孵育2小時(shí)、洗膜，用ECL試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以GAPDH為內(nèi)參，分析各組蛋白表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1.Skp2和p27在CRC組織、癌旁組織和細(xì)胞系中的表達(dá)：與癌旁組織相比，CRC組織中Skp2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，p27 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表2。與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CoN相比，LS513、SW480、HT29和SW620癌細(xì)胞中Skp2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，p27 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3和圖1。其中，LS513癌細(xì)胞中Skp2表達(dá)水平最高，所以后續(xù)將選擇LS513細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾載體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

注：A 癌旁組織；B CRC組織；C CCD841CoN正常結(jié)腸上皮細(xì)胞；D SW480癌細(xì)胞；E HT29癌細(xì)胞；F SW620癌細(xì)胞；G LS513癌細(xì)胞

表2 CRC組織和癌旁組織中Skp2和p27 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

表3 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞細(xì)胞和癌細(xì)胞中Skp2和p27 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.干擾Skp2對(duì)LS513癌細(xì)胞增殖活性的影響：與LS513組比較，siRNA NC組細(xì)胞Skp2蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組比較，siRNA Skp2組細(xì)胞Skp2蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 干擾Skp2對(duì)LS513癌細(xì)胞增殖活性的影響

3.干擾Skp2對(duì)LS513癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響：與LS513組相比，siRNA NC組細(xì)胞遷移和侵襲能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)。見圖2和表5。

圖2 Transwell檢測(cè)LS513癌細(xì)胞遷移侵襲圖(結(jié)晶紫染色×200)

表5 干擾Skp2對(duì)LS513癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

4.干擾Skp2對(duì)LS513癌細(xì)胞成瘤能力的影響：與LS513組比較，siRNA NC組細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組比較，siRNA Skp2組細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力顯著降低(P<0.05)。見表6。

表6 干擾Skp2對(duì)LS513癌細(xì)胞成瘤能力的影響

5.干擾Skp2對(duì)LS513癌細(xì)胞p27、p21、p57和CKS1蛋白表達(dá)水平的影響：與LS513組比較，siRNA NC組細(xì)胞p27、p21、p57和CKS1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細(xì)胞p27、p21、p57蛋白表達(dá)水平顯著升高，CKS1蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表7。

圖3 各組細(xì)胞中p27、p21、p57和CKS1蛋白Western Blot圖

表7 干擾Skp2對(duì)p27、p21、p57和CKS1蛋白表達(dá)水平的影響

討論

CRC是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第3[9]。癌癥的發(fā)生主要是由于癌基因和抑癌基因相互作用導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)所引起[10]。其中，Skp2基因是與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的基因，編碼的蛋白質(zhì)由436個(gè)氨基酸組成，分子量約47 kDa，Skp2通過對(duì)多種靶蛋白的泛素化降解而與細(xì)胞周期調(diào)控及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[11]。Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在CRC組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，敲除Skp2在體外和體內(nèi)均可降低CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)，且Skp2高表達(dá)與CRC預(yù)后差相關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞相比，CRC組織及LS513、SW480、HT29和SW620癌細(xì)胞中Skp2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，p27 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，其中LS513癌細(xì)胞中Skp2表達(dá)水平最高，所以后續(xù)將選擇LS513細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾。

Skp2在多種人類腫瘤中均過表達(dá)，具有潛在的致癌效應(yīng)，調(diào)控多種細(xì)胞生物進(jìn)程，包括細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、分化、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡[13]。其中，Skp2的過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，凋亡和侵襲，而siRNA Skp2可以降低HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]，另外，Skp2抑制劑也可降低多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生存和增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)能高效特異干涉目標(biāo)靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。本研究采用siRNA Skp2處理后發(fā)現(xiàn)，與siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細(xì)胞Skp2蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移侵襲能力及動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力顯著降低。Skp2在骨肉瘤細(xì)胞中主要發(fā)揮癌基因的作用，通過調(diào)控其信號(hào)通路中p21和p27的表達(dá)影響細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為[16]。提示Skp2在CRC細(xì)胞中也發(fā)揮癌基因作用，干擾Skp2可抑制CRC癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移侵襲，但其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Skp2參與p27、p21、p57等抑癌蛋白的降解，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[17]。精確地細(xì)胞周期調(diào)節(jié)是防止異常細(xì)胞增殖和癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵，p21、p27和p57均為典型的細(xì)胞周期抑制蛋白，其過度降解可能導(dǎo)致癌細(xì)胞不受控制的增殖[18]，而CKS1基因控制細(xì)胞周期蛋白的豐度[19]，在肝癌組織中CKS1表達(dá)水平顯著高于正常肝組織[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細(xì)胞p27、p21、p57蛋白表達(dá)水平顯著升高，CKS1蛋白表達(dá)水平顯著降低。Vasile等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Skp2過表達(dá)可誘導(dǎo)p27蛋白連續(xù)降解，而蛋白水解和降解需要依賴CKS1為輔助因子[22]。提示干擾Skp2可能通過提高p27等抑癌蛋白表達(dá)水平，降低CKS1蛋白表達(dá)水平，抑制CRC癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移侵襲，進(jìn)而影響CRC發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，Skp2/p27軸參與CRC發(fā)生發(fā)展，干擾Skp2可增高p27等抑癌蛋白表達(dá)，降低CKS1癌蛋白表達(dá)，抑制CRC細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移侵襲。推測(cè)靶向Skp2可能是一種潛在的CRC治療策略。