屈青云 許 偉 胡 源 李銀花 龔志華 肖文軍,2

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128)

腸道是機體消化吸收營養(yǎng)物質的場所，也是重要的免疫器官，腸道免疫功能的提高對維持內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)衡、提高機體抗病能力具有重要作用[1-2]。通過膳食營養(yǎng)干預來保護腸道完整性、減輕腸道炎癥、維護腸道菌群微生態(tài)平衡已成為一種提高腸道免疫功能的有效途徑[3-4]。隨著人們生活水平的提高，采用多元化的營養(yǎng)素進行腸內(nèi)營養(yǎng)是現(xiàn)代膳食營養(yǎng)的重要發(fā)展方向。研究[5]發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺聯(lián)合膳食纖維強化腸內(nèi)營養(yǎng)能較好地維持腸道正常適度的免疫反應，減輕過度的炎癥反應，提高腸道黏膜免疫能力。其中，谷氨酰胺是腸道免疫重要關聯(lián)物質，主要依靠其他器官合成或外源性攝入，可促進腸道細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的產(chǎn)生，對調(diào)節(jié)細胞免疫具有重要作用[6]；膳食纖維可在腸道微生物的作用下發(fā)酵形成短鏈脂肪酸(SCFAs)，其在腸道供能、改善腸道形態(tài)結構、增強腸道免疫功能等方面發(fā)揮積極作用[7]。

常見的膳食纖維主要有纖維素、半纖維素、果膠、樹膠和木質素等[8]。抗性淀粉(RS)是一種極具潛力的新型膳食纖維，不僅在持水力、色澤、口感等方面擁有更好的性能，而且具有調(diào)節(jié)腸道pH值、預防結腸癌、改善腸道菌群和提高腸道免疫力等作用[9-10]。但抗性淀粉的長期攝入對腸道內(nèi)環(huán)境的積極作用會逐漸減弱，且由于RS在小腸中不易被酶消化，其在腸道中的存在也會影響腸道內(nèi)容物的物理特性，從而改變小腸消化和營養(yǎng)吸收的程度[11]。L-茶氨酸(L-theanine)是茶葉中一種特征性氨基酸，與谷氨酰胺結構類似，不僅可以作為一種外源營養(yǎng)補充物質，同時可通過改善腸道結構、促進免疫球蛋白分泌、降低白介素含量、下調(diào)炎癥因子水平等途徑提高腸道免疫力[12]，此外，氨基酸發(fā)酵也可產(chǎn)生大量的SCFAs[13]。由此可見，抗性淀粉與L-茶氨酸均有利于腸道健康，但其組合營養(yǎng)是否具有協(xié)同增效作用還有待進一步探究。為此，試驗擬通過不同劑量L-茶氨酸灌胃干預抗性淀粉飲食模式下的SD雄性大鼠28 d，研究分析抗性淀粉和L-茶氨酸的組合腸內(nèi)營養(yǎng)對大鼠腸道免疫功能的調(diào)節(jié)作用，以期為食品營養(yǎng)干預多元化發(fā)展、改善腸道免疫功能以及L-茶氨酸的深層次利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-茶氨酸：純度≥98%，湖南三福生物科技有限公司；

抗性淀粉II(商標號：Fibersol-2)：上海友山生物科技有限公司；

抗性淀粉飼料：參照文獻[14]了解抗性淀粉的功能及營養(yǎng)配比后，委托湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，在基礎飼料配方上添加抗性淀粉II制成，其組成：2%抗性淀粉II，18%蛋白質(供能比24.7%)，58%碳水化合物(供能比67.1%)，4.8%脂質(供能比8.2%)和3%礦物質；

谷氨酰胺(Gln)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)ELISA試劑盒：上海茁彩生物科技有限公司；

谷氨酸(Glu)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

SD雄性大鼠：SPF級4周齡，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 主要儀器設備

多功能酶標儀：Varioskan Flash型，賽默飛世爾上海儀器有限公司；

臺式冷凍離心機：MIKRO22R型，德國Hettich公司；

移液槍：Reerach Plus型，德國Eppendorf公司；

全自動樣品快速研磨儀：JXFSTPRP-48型，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2550型，日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 動物試驗設計 所有涉及動物的試驗程序嚴格按照湖南農(nóng)業(yè)大學倫理委員會《動物護理和使用指南》進行(注冊號：015063506)。試驗動物選擇SPF級4周齡SD雄性大鼠，飼養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃、濕度(50%～70%)，12 h的光/暗周期，保持動物房空氣流通。大鼠分組前適應性喂養(yǎng)1周，期間自由進食飲水。

將50只大鼠按體重隨機分為基礎飼料對照組(CK A)、抗性淀粉飼料對照組(CK B)和L-茶氨酸低劑量組(LTA 100)、中劑量組(LTA 300)、高劑量組(LTA 500)共5組，每組10只，喂養(yǎng)周期為28 d，大鼠分組及喂養(yǎng)如表1所示。

1.3.2 樣品采集與檢測 末次灌胃后，經(jīng)禁食12 h，收集各組大鼠糞便，置于干燥的滅菌試管中，隨后注射戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，解剖收集每只大鼠的十二指腸、空腸、回腸組織，糞便與腸道組織均-80 ℃貯藏備用。試驗指標檢測嚴格按照試劑盒操作。

1.3.3 腸道微生物DNA提取與測序 使用EZNA Soil DNA試劑盒對大鼠糞便進行總DNA抽提，使用特異引物對糞便中細菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增、純化，以及文庫模板的富集和測序文庫的構建，隨后在Illumina Miseq PE300平臺上進行測序。

表1 大鼠分組及喂養(yǎng)Table 1 The grouping and feeding of rats

測序數(shù)據(jù)經(jīng)使用Trimmomatic軟件質控、FLASH拼接、Verseach過濾得到優(yōu)質序列，利用軟件Uparse對所有樣品的有效數(shù)據(jù)進行聚類，將具有97%一致性序列聚類成為操作單元(OTUs)，采用RDP Classifier對OTUs代表序列進行分類和注釋，與Silva(SSU123)數(shù)據(jù)庫進行比對，置信水平設置為70%?；跇悠稯TUs結果，使用Mothur軟件對樣品進行Alpha多樣性分析，并在門與屬分類水平上，進行腸道菌群結構分析。

1.3.4 統(tǒng)計分析方法 試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，最小顯著差數(shù)法(LSD)和鄧肯(Duncan)檢驗，P<0.05時為具有統(tǒng)計學顯著性差異。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠體重與采食量的影響

表2顯示，各處理組日均采食量無顯著差異(P>0.05)。與CK A組相比，CK B組大鼠體重稍下降(P>0.05)，可能與抗性淀粉降低機體脂肪沉積量有關[15]。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組大鼠體重變化量顯著增加(P<0.05)，說明抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸能促進大鼠生長，與童海鷗等[16]的結論基本一致。

2.2 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠回腸組織酶活性及MDA含量的影響

如圖1所示，與CK A組相比，CK B組大鼠回腸組織中SOD、GSH-Px活性升高，iNOS活性和MDA含量降低，其中iNOS達到顯著水平(P<0.05)。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組均能增加大鼠回腸組織中SOD、GSH-Px活性(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)。由于腸道系統(tǒng)不僅是代謝部位，也是宿主和微生物之間的作用位點，腸道細胞新陳代謝、日糧成分氧化、腸道微生物改變等均會影響腸道氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡[17]。由此說明抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸能提高SOD、GSH-Px活性，抑制iNOS活性及減少MDA形成來平衡腸道自由基，維護腸道健康。

表2 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠體重變化量與日均采食量的影響?Table 2 Effects of L-theanine on the weight change and average daily feed intake of rats under resistant starch feeding g

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠回腸組織中SOD、GSH-Px、iNOS活性和MDA含量的影響Figure 1 Effects of L-theanine on SOD,GSH-Px,iNOS activities and MDA content in ileum of rats under resistant starch feeding

2.3 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠回腸細胞因子表達水平的影響

由圖2可知，與CK A組相比，CK B組大鼠回腸IL-4、IL-10表達量顯著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α表達量顯著降低(P<0.05)，說明抗性淀粉可通過改善炎癥因子水平來平衡腸道穩(wěn)態(tài)，與曹承嘉[18]的研究結果相符。與CK B組相比，各L-茶氨酸劑量組IL-4、IL-10表達量顯著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α表達量顯著降低(P<0.05)，說明在抗性淀粉飲食模式下，L-茶氨酸干預可進一步調(diào)節(jié)促炎/抗炎因子平衡，且具有劑量依賴效應。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠回腸中細胞因子表達量的影響Figure 2 Effects of L-theanine on the levels of cytokines in ileum of rats under resistant starch feeding

2.4 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠回腸IgA的影響

由圖3可知，與CK A組相比，CK B組大鼠回腸IgA含量顯著增加(P<0.05)。與CK B相比，各L-茶氨酸劑量組IgA含量顯著升高(P<0.05)，其中，以LTA 300組效果最佳，由此提示抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸能通過促進IgA分泌增強腸道免疫應答[19]。

2.5 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠腸道Glu、Gln的影響

由表3可知，與CK A組相比，CK B組腸道Glu、Gln的含量降低，且空腸和十二指腸達到顯著水平(P<0.05)，可能與抗性淀粉降低腸道氮的吸收和促進大腸微生物發(fā)酵而增加微生物蛋白質合成有關[20]，同時回腸Glu、Gln含量有所降低，但并不顯著(P>0.05)，可能是抗性淀粉在小腸后段消化率較高的緣故[21]。與CK B組相比，不同劑量的L-茶氨酸干預均增加了腸道Glu、Gln的含量，其中LTA 100組十二指腸、空腸Gln，LTA 300組十二指腸、空腸Glu以及十二指腸、空腸、回腸Gln，LTA 500組十二指腸、空腸、回腸中Glu和Gln含量達到顯著水平(P<0.05)，說明抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸干預能提高腸道Glu和Gln的含量，一方面可能是由于L-茶氨酸能改善腸道形態(tài)結構并促進腸道營養(yǎng)吸收[22]，另一方面，L-茶氨酸降解可增加Gln合成底物Glu的濃度，并通過提高骨骼肌中谷氨酰胺合成酶活性和促進腸道谷氨酰胺酶蛋白的翻譯和修飾影響腸道Gln代謝[12]。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠回腸中IgA含量的影響Figure 3 Effect of L-theanine on the content of IgA in ileum of rats under resistant starch feeding

表3 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠腸道Glu、Gln的影響?Table 3 Effects of L-theanine on the contents of Glu and Gln in intestinal of rats under resistant starch feeding μmol/g

2.6 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠腸道菌群的影響

如表4所示，5組樣本的測序深度指數(shù)在99.70%～99.80%，說明測序深度足以反映樣本中所包含的絕大多數(shù)序列，能進行下一步分析。LTA 500組ACE、Chao、Shannon指數(shù)最大，其中ACE指數(shù)與CK B組相比達到顯著水平(P<0.05)，各L-茶氨酸劑量組Simpson指數(shù)顯著降低(P<0.05)。由此提示，抗性淀粉聯(lián)合L-茶氨酸進行營養(yǎng)干預能提高大鼠腸道微生物豐富度和多樣性，進而影響腸道菌群組成。

原始測序結果經(jīng)過質控優(yōu)化后在分類學上共得到805個OTUs，可劃分為13個門，19個綱，31個目，57個科，161個屬，287個種。圖4顯示，各組樣本在門水平上群落結構差異不大，主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、ε-變形菌門(Epsilonbacteraeota)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)6個門構成，其中擬桿菌門和厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，約占總序列數(shù)的90%，與Ericsson等[23]的研究結果一致。由圖4及表5可知，與CK A組相比，CK B組厚壁菌門相對豐度下降，擬桿菌門相對豐度增加，二者比值有所上升(P>0.05)。擬桿菌門在碳水化合物發(fā)酵、含氮物質的利用、抵抗病原體定植和促進腸道菌群平衡等活動中發(fā)揮重要作用[24]，同時，擬桿菌門與厚壁菌門的比值與動物機體的能量代謝相關[25]。Kyu-Ho等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高膳食纖維補充日糧能顯著降低正常飲食大鼠腸道厚壁菌門與擬桿菌門的比值，與試驗結果相符。與CK B組相比，L-茶氨酸各劑量組均能降低厚壁菌門，提高擬桿菌門的相對豐度，并降低其比值(P>0.05)，提示抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸可能具有調(diào)節(jié)宿主能量代謝的作用。

圖5表明，在屬的分類學水平上，5組樣本中的主要優(yōu)勢菌屬有普雷沃菌屬9(Prevotella_9)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、副桿菌屬(Parabacteroides)和鼠桿菌科未命名屬(Muribaculaceae_norank)，4個屬相對豐度占比50%以上，選取相對豐度前30位的屬進行顯著性差異分析，得到表6。由表6可知，與CK A組相比，CK B組副桿菌屬、毛螺菌科未命名屬(Lachnospiraceae_norank)、瘤胃梭菌屬5(Ruminiclostridium_5)、木質真菌屬([Eubacterium]_xylanophilum_group)、擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和布勞特氏菌屬(Blautia)豐度顯著增加(P<0.05)，擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、幽門螺桿菌屬(Helicobacter)、副薩特氏菌屬(Parasutterella)豐度顯著降低(P<0.05)。而L-茶氨酸可進一步改善抗性淀粉飲食模式下的腸道菌群結構。與CK B組相比，LTA 300組顯著上調(diào)副桿菌屬，顯著下調(diào)鼠桿菌科未命名屬的相對豐度(P<0.05)；LTA 500組顯著上調(diào)毛螺菌科NK4A136群屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group)和雙歧桿菌屬的相對豐度(P<0.05)；LTA 300、LTA 500組均能顯著上調(diào)普雷沃菌屬9和布勞特氏菌屬，下調(diào)普雷沃菌科NK3B31群屬(Prevotellaceae_NK3B31_group)、幽門螺桿菌屬和副薩特氏菌屬的相對豐度(P<0.05)。雙歧桿菌屬是一種常見益生菌，不僅能抑制有害細菌和炎癥細胞因子分泌，還可改變樹突狀細胞的功能，以調(diào)節(jié)腸道對無害抗原和細菌的免疫穩(wěn)態(tài)[26]；副桿菌屬、普雷沃菌屬9、布勞特氏菌屬由于與免疫關聯(lián)物質SCFAs的產(chǎn)生有關，被認為是益生菌或潛在益生菌。SCFAs是抗性淀粉在大腸內(nèi)被腸道菌群發(fā)酵利用產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸和丁酸等[27]。副桿菌屬主要代謝終產(chǎn)物為有益的乙酸、丙酸，幫助調(diào)節(jié)腸道菌群[28]；普雷沃菌屬9、布勞特氏菌屬參與丁酸鹽的產(chǎn)生，為腸道上皮細胞提供能源[29]。與CK A組相比，CK B組雙歧桿菌屬、副桿菌屬、布勞特氏菌屬等菌屬豐度增加(P<0.05)，說明抗性淀粉能通過影響SCFAs產(chǎn)生而促進腸道有益菌的生長。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組普雷沃菌屬9、副桿菌屬、布勞特氏菌屬豐度顯著增加(P<0.05)，可能是L-茶氨酸能很好地被腸道微生物發(fā)酵利用，進而生成SCFAs[30]45-50，影響腸道內(nèi)環(huán)境、促進腸道有益菌生長的原因。幽門螺桿菌屬、副薩特氏菌屬與腸道健康呈負相關，幽門螺桿菌屬是一種慢性致病菌，定植在機體內(nèi)易引起炎癥[31]；副薩特氏菌屬豐度增加會導致菌群紊亂，易引起腸易激綜合征、科恩氏病[32]。表6中，與CK A組相比，CK B組幽門螺桿菌、副薩特氏菌等菌屬豐度降低(P<0.05)，可能與抗性淀粉降低腸道pH值，抑制部分有害菌群生長有關[33]。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組幽門螺桿菌、副薩特氏菌豐度顯著降低(P<0.05)，可能是由于L-茶氨酸能促進乳酸等SCFAs的生成[30]51，進一步降低腸道pH值。由此可知，抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸可通過提高腸道益生菌和潛在益生菌豐度、降低致病菌豐度來改善腸道菌群結構。

表4 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠腸道菌群豐富度及多樣性的影響?Table 4 Effects of L-theanine on the richness and diversity of intestinal bacteria in rats under resistant starch feeding

圖4 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對門水平上的大鼠腸道菌群結構的影響Figure 4 Effect of L-theanine on the structure of intestinal bacteria in rats at gate level under resistant starch feeding

表5 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠腸道菌群厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度及其比值的影響Table 5 Effects of L-theanine on the relative abundance and ratio of Firmicutes and Bacteroidetes of intestinal bacteria in rats under resistant starch feeding

圖5 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對屬水平上的大鼠腸道菌群結構的影響Figure 5 Effect of L-theanine on the structure of intestinal bacteria in rats at genus level under resistant starch feeding

表6 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對大鼠腸道菌群優(yōu)勢屬相對豐度的影響?Table 6 Effects of L-theanine on the relative abundance of intestinal bacteria in rats at main genus under resistant starch feeding

3 結論

試驗表明，在抗性淀粉飲食模式下使用L-茶氨酸進行營養(yǎng)干預，一方面能夠提高腸道抗氧化能力、平衡促炎/抗炎因子、提高腸道Glu與Gln含量，增強腸道免疫應答能力。另一方面，能夠通過提高腸道菌群多樣性、改善腸道菌群結構來增強腸道免疫功能，但其作用機制有待進一步探究。