劉文蘭，王莉，楊揚(yáng)，閆瑾，朱丹，李怡琛

(西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710021)

白內(nèi)障指眼部晶狀體混濁，是世界上致盲的主要因素，占所有致盲病例的47.8%[1-3]。囊外晶狀體纖維摘除和人工晶狀體植入等手術(shù)是治療白內(nèi)障的主要手段[4-5]。然而，白內(nèi)障手術(shù)后可能導(dǎo)致繼發(fā)性晶狀體混濁，也稱為后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)，是術(shù)后最常見的并發(fā)癥[6-8]。術(shù)后殘留在前囊膜周邊部和赤道部的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)增殖并遷移到后囊，并且進(jìn)行上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是PCO發(fā)展中的一個(gè)關(guān)鍵過程[9-10]。LECs在EMT過程中失去上皮細(xì)胞的特征，包括上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E鈣粘蛋白(E-cadherin)的下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)記物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)水平上升，從而獲得間充質(zhì)特性，并合成細(xì)胞外基質(zhì)[11]。因此，抑制EMT是治療PCO的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，microRNAs參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程已被學(xué)界普遍認(rèn)同[12]。此外，最近的證據(jù)[13]表明，許多miRNA在晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道[14-15]，MicroRNA-146a(miR-146a)是許多腫瘤包括胃癌、前列腺癌和乳腺癌的已知腫瘤抑制因子，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和EMT等多種細(xì)胞生理和代謝機(jī)制。本研究擬探討miR-146a在調(diào)節(jié)LEC細(xì)胞EMT中的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器設(shè)備

HLE-B3購自上海賽百慷公司；Dulbecco’s改良鷹培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基(Gibco，USA)、miR-146a的模擬物(miR-146a mimics)和陰性對(duì)照模擬物(miR-NC)均購自上海生工生物有限公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒(Tiangen，Beijing)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物設(shè)計(jì)合成；放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液(Beyotime，Beijing)、抗Notch1抗體(Abcam公司)、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(美國CST公司)、抗E-鈣粘蛋白抗體(美國CST公司)、抗波形蛋白抗體(美國CST公司)、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的抗體(美國Proteintech)HRP標(biāo)記二抗(北京Solarbio公司)、DAPI一抗(美國CST公司)、pmirGLO載體(Promega，USA)購自試劑代理公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人晶狀體上皮細(xì)胞HLE-B3細(xì)胞株在10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基、37 °C和5% CO2的MCO-18AC細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待匯合度達(dá)到80%左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Control組)、TGF- β處理組(TGF-β組)、TGF-β處理+miR-NC轉(zhuǎn)染組(TGF-β+miR-NC組)和TGF-β處理+miR164a mimics轉(zhuǎn)染組(TGF-β+miR146a mimics組)。miR-146a mimics序列為5’-CTT TGA GAA CTG AAT TCC ATG GGT TGT GTC AGT GTC AGA CC-3；miR-NC序列為5’-CAG CAG TTC TAT TAG ACT GTG TAT CTA AGC TTT GTT GTC CCT A-3。嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行規(guī)范操作，以Lipofectamine 2000對(duì)TGF-β+miR-NC組和TGF-β+miR14a mimics組的兩組HLE-B3細(xì)胞分別進(jìn)行miR-NC和miR-146a mimics的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4 h后，根據(jù)分組需要將兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞和TGF-β組細(xì)胞與含有10 ng/mL TGF-β的HLE-B3細(xì)胞孵育48 h。單獨(dú)TGF-β誘導(dǎo)則以10 ng/mL TGF-β處理HLE-B3細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步的檢測(cè)和分析。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

收集處理的培養(yǎng)細(xì)胞，按照說明書操作步驟，以總RNA提取試劑盒提取總RNA，以M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將提取的100 ng 總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA樣本。cDNA第一鏈的合成按照說明書進(jìn)行，cDNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)程序：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，擴(kuò)增體系20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃ 10 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 34 s)。相關(guān)基因的mRNA表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參基因，micro-RNA以U6內(nèi)參基因，讀取每個(gè)基因的Ct值，以2-ΔΔCt表示基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1所示。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.4 Western blot

以含有蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟的RIPA裂解緩沖液對(duì)培養(yǎng)的LECs細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解物制備，參照既往研究中Western blot的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作[16]，根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒定量，然后在SDS-PAGE凝膠凝膠上進(jìn)行電泳、分離，再轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF]膜上轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶溶液室溫封閉2 h，添加一抗：抗Notch1(1∶1 000)、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，1∶500)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin，1∶500)、波形蛋白(1∶500)、抗GAPDH(1∶500)，4 ℃孵育過夜，次日PVDF膜恢復(fù)室溫后用TBST洗膜3次，每次8 min，分別加入二抗HRP標(biāo)記二抗(1∶3 000)，室溫下孵育1 h，再次用TBST 洗膜3次，每次8 min，最后加電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯影液顯影。GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J軟件分析結(jié)果。蛋白表達(dá)水平以與內(nèi)參比值的平均灰度表示。

1.5 免疫熒光分析

處理培養(yǎng)后的LECs細(xì)胞在室溫下依次以4%多聚甲醛固定15 min，用0.1% tritonX-100通透處理30 min，再以1%山羊血清封閉15 min，與相應(yīng)DAPI一抗(1∶200)以及抗α-SMA抗體(1∶200)4 ℃下孵育過夜，然后與相應(yīng)的Cy3標(biāo)記的二級(jí)抗體在37 ℃下孵育1 h。以DAPI進(jìn)行核復(fù)染后，用抗熒光淬滅封片劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光猝滅，在400倍放大的熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

通過使用TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://www.mirdb.org)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索miR-146a靶向目的基因Notch1的結(jié)合位點(diǎn)。在HEK 293 T細(xì)胞中構(gòu)建雙熒光素酶基因報(bào)告分析。通過PCR擴(kuò)增Notch1的野生型(WT)3′-UTR序列，并將其克隆到pmirGLO載體中，采用點(diǎn)突變法擴(kuò)增Notch1突變株(MUT)3′-UTR序列(突變位點(diǎn)位于3′-UTR 序列242-263 region)，并克隆到pmirGLO載體中。使用Lipofectamine 2000試劑將pmirGLO-Notch1-3′-UTR-WT或pmirGLO-Notch1-3′-UTR-MUT與miR-146amimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，按照試劑盒說明書操作流程，通過雙熒光素酶報(bào)告試劑盒測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TGF-β誘導(dǎo)的LECs細(xì)胞中miR-146a和Notch1表達(dá)變化

與正常對(duì)照組LECs細(xì)胞相比，TGF-β誘導(dǎo)LECs細(xì)胞后miR-146a表達(dá)水平降低，而Notch1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 microRNA-146a可抑制TGF-β誘導(dǎo)的LECs細(xì)胞EMT

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，TGF-β處理LECs細(xì)胞后，促進(jìn)LECs細(xì)胞的間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Vimentin表達(dá)上升，而上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-146a mimics后可抑制TGF-β誘導(dǎo)的α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)上升，并提升E-cadherin的表達(dá)水平(P<0.05)。見圖2。免疫熒光法發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)α-SMA在LECs細(xì)胞中的免疫反應(yīng)性顯著增加，轉(zhuǎn)染miR-146a mimics后可顯著逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT反應(yīng)變化。見圖3。TGF-β可誘導(dǎo)LECs細(xì)胞的EMT，而miR-146a抑制了TGF-β誘導(dǎo)的LECs細(xì)胞EMT。

2.3 miR-146a通過靶向調(diào)控Notch1的表達(dá)

通過利用TargetScan Human 7.2(http://www.targetscan.org)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，Notch1 mRNA的3′-UTR序列242-263預(yù)測(cè)是miR-146a的結(jié)合序列，提示Notch1可能是miR-146a的靶基因之一。采用雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行靶向分析，結(jié)果顯示：當(dāng)pmirGLO-Notch1-3′UTR-WT和miR-146a模擬物共轉(zhuǎn)染時(shí)，相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。此外，pmirGLO-Notch1-3′UTR-MUT和miR-146a模擬物共轉(zhuǎn)染不抑制熒光素酶的相對(duì)活性，確認(rèn)miR-146a直接靶向Notch1 mRNA的3′UTR。見圖4。

3 討論

本研究利用TGF-β誘導(dǎo)LECs細(xì)胞建立PCO細(xì)胞模型，證明TGF-β誘導(dǎo)后LECs細(xì)胞發(fā)生EMT。早有研究[17]報(bào)道，TGF-β、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)等多種細(xì)胞因子可觸發(fā)EMT。且TGF-β被發(fā)現(xiàn)在白內(nèi)障術(shù)后的房水中顯著升高，活化后的TGF-β對(duì)術(shù)后殘留LECs的增生、遷移和轉(zhuǎn)分化等細(xì)胞過程中起著關(guān)鍵性作用，是LECs在各種生理、病理過程中最重要的調(diào)節(jié)因子之一[18]。Zavadil等[19]報(bào)道，TGF-β呈劑量和時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)LECs細(xì)胞通過TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活，促使LECs細(xì)胞的EMT發(fā)生。而本研究顯示LECs細(xì)胞經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)后胞漿中的間質(zhì)標(biāo)記物α-SMA顯著表達(dá)上升，利用Western blot進(jìn)一步分析細(xì)胞蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)后LECs細(xì)胞中不僅間質(zhì)標(biāo)記物α-SMA、Vimentin表達(dá)上升，且上皮標(biāo)志物E-cadherin顯著下降，表明LECs細(xì)胞表現(xiàn)出失去細(xì)胞極性而向間質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變，獲得間質(zhì)特征。綜合既往研究結(jié)果，提示TGF-β在LECs細(xì)胞EMT中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而參與PCO的發(fā)生。

miR-146a通常被認(rèn)為涉及調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、遷移和凋亡等多種生理過程[20]。但也有越來越多的證據(jù)[21]表明，miR-146a參與包括白內(nèi)障等在內(nèi)的各種眼部疾病發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制。有研究[22]顯示，miR-146a與血管性眼科疾病有關(guān)，在濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)患者的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中miR-146a顯著上調(diào)，并通過參與調(diào)節(jié)補(bǔ)體因子H(complement factor H，CFH)介導(dǎo)的炎癥影響發(fā)揮作用[23]。而Poe等[24]通過整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析揭示了miR-146a通過Notch信號(hào)在人角膜緣上皮中介導(dǎo)傷口愈合、炎癥、干細(xì)胞維持和分化等調(diào)節(jié)作用。而本研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-146a在TGF-β誘導(dǎo)的LECs細(xì)胞中表達(dá)下降，而轉(zhuǎn)染miR-146a mimic能明顯抑制TGF-β誘導(dǎo)的LECs細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，提示miR-146a可能參與白內(nèi)障術(shù)后PCO的發(fā)生過程，并且miR-146a通過抑制TGF-β誘導(dǎo)的LECs-EMT來發(fā)揮關(guān)鍵作用。

此外，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch1是miR-146a的靶基因之一。Notch1屬于Notch蛋白家族，Notch1蛋白激活可通過介導(dǎo)多種EMT相關(guān)基因的表達(dá)從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[25]。抑制Notch1激活可減弱TGF-β誘導(dǎo)的EMT，表現(xiàn)為E-cadherin表達(dá)減少，而α-SMA、snail等表達(dá)增加[26]。Notch信號(hào)在PCO發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用。Han等[27]表明，miR-34a通過靶向Notch1能抑制LECs細(xì)胞的EMT發(fā)生，并且利用Notch1的小分子抑制劑DAPT也可以有效抑制TGFβ誘導(dǎo)后LECs細(xì)胞中α-SMA、Vimentin、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的表達(dá)上升，從而減輕LECs細(xì)胞中TGFβ誘導(dǎo)的EMT。而本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)利用TGFβ刺激LECs細(xì)胞后，不但miR-146a表達(dá)水平下降，且Notch1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均明顯上升，提示miR-146a和 Notch1可能參與TGF-β誘導(dǎo)的LECs-EMT。結(jié)合miR-146a可以通過靶向調(diào)控Notch1，推測(cè)miR-146a抑制TGF-β誘導(dǎo)的LECs-EMT發(fā)生，可能是通過靶向調(diào)節(jié)Notch1的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，miR-146a通過靶向調(diào)節(jié)Notch1的表達(dá)，抑制Notch1信號(hào)通路的激活，從而阻斷TGF-β誘導(dǎo)的LECs-EMT，為臨床預(yù)防和治療白內(nèi)障術(shù)后PCO發(fā)生提供了一個(gè)新的理論策略途徑。