王軍凱，王衛(wèi)東，蔣 明，代利平，黃祖耀

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223700)

淀粉是一種高分子碳水化合物，是由葡萄糖聚合而成的多糖。在釀酒生產(chǎn)中，淀粉質(zhì)糧食是重要的釀酒原料。作為釀酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑，大曲以大麥、小麥等為原料，粉碎后由人工控制適當(dāng)?shù)乃帧囟?、疏松度等條件來(lái)選擇、富集有益微生物培育而成[1]。大曲的淀粉含量反映了大曲發(fā)酵的成熟程度，是評(píng)判大曲質(zhì)量好壞的一個(gè)重要指標(biāo)[2]。傳統(tǒng)的淀粉含量檢測(cè)方法為酸水解法。酸水解法檢測(cè)淀粉含量需用強(qiáng)酸作催化劑，檢測(cè)過(guò)程中還需用強(qiáng)堿中和多余的酸。在水解過(guò)程中，強(qiáng)酸會(huì)使半纖維素等一些非淀粉多糖水解為還原糖。因此，酸水解法更適用于淀粉含量較高的樣品[3]。

糖化酶，又稱(chēng)葡萄糖淀粉酶，是一種單鏈酸性糖苷鍵水解酶，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)水解糖苷鍵將淀粉逐步降解為葡萄糖，具有性能穩(wěn)定、水解安全的優(yōu)點(diǎn)[4-6]。根據(jù)糖化酶的水解原理，本研究通過(guò)對(duì)比大曲淀粉經(jīng)酸水解和酶水解后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶水解法檢測(cè)大曲淀粉含量操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，避免了強(qiáng)堿強(qiáng)酸的使用，可應(yīng)用于大曲淀粉的日常檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：大曲為釀酒車(chē)間使用曲，糖化酶（10萬(wàn)U/g）由無(wú)錫市雪酶酶制劑科技有限公司提供。

試劑及耗材：斐林氏甲液、乙液、1 g/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、20 %（V/V）鹽酸溶液、20 %（W/V）氫氧化鈉溶液、可溶性淀粉。所用化學(xué)藥品均為分析純，均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

儀器設(shè)備：TCS-100 型標(biāo)準(zhǔn)COD 消解器、分析天平、三角瓶、容量瓶、量筒、電爐、酸式滴定管。

1.2 酸水解法

1.2.1 檢測(cè)原理

淀粉在強(qiáng)酸和高溫作用下，葡萄糖苷鏈裂解，生成不同分子量的糖類(lèi)聚合物，最終生成葡萄糖。酸水解后的溶液用堿中和至微酸性，按斐林氏法測(cè)定還原糖含量，最后折算為淀粉含量。

1.2.2 檢測(cè)步驟

1.2.2.1 試樣酸水解

準(zhǔn)確稱(chēng)取大曲樣品5.0 g 于250 mL 三角瓶中，加入20 %鹽酸溶液100 mL，將三角瓶放于消解器中高溫消解2 h。消解完成后取出三角瓶并冷卻，用20 %的氫氧化鈉溶液中和至微酸性（pH 試紙驗(yàn)證），脫脂棉過(guò)濾至500 mL 容量瓶，濾液搖勻并定容。

1.2.2.2 試樣測(cè)定

空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取斐林氏甲液、乙液各5.0 mL于100 mL 三角瓶中，預(yù)先向三角瓶?jī)?nèi)加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液9.0 mL左右，混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱，沸騰后，緩慢滴入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，待三角瓶?jī)?nèi)藍(lán)色消失，記錄空白試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液量。

樣品試驗(yàn)：樣品預(yù)滴定：準(zhǔn)確吸取甲液、乙液各5.0 mL 以及1.0 mL 樣品濾液于100 mL 三角瓶中，混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱，沸騰后，緩慢滴入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，待三角瓶?jī)?nèi)藍(lán)色消失，記錄葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量；樣品滴定：準(zhǔn)確吸取甲液、乙液各5.0 mL 以及1.0 mL 樣品濾液于100 mL三角瓶中，預(yù)先加入比預(yù)滴定少1.0 mL左右的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱，沸騰后，緩慢滴入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，待三角瓶?jī)?nèi)藍(lán)色消失，記錄樣品試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液量。計(jì)算：

式中：V0——空白試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液量，mL；

V——樣品試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液量，mL；

C——葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，g/L；

500——樣品濾液定容體積，mL；

1——滴定時(shí)溶液的取樣量，mL；

0.9——葡萄糖換算成淀粉的系數(shù)；

m——試樣質(zhì)量，g。

1.3 酶水解法

1.3.1 檢測(cè)原理

糖化酶為糖苷鍵水解酶，在其最適反應(yīng)條件下，促使淀粉中的糖苷鍵斷裂，最終生成葡萄糖。本試驗(yàn)所使用的糖化酶由黑曲霉優(yōu)良菌種經(jīng)深層發(fā)酵精制而成，在其最適反應(yīng)條件下，能將淀粉逐步水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖，糖化效率高。為加速淀粉糖化，首先對(duì)淀粉進(jìn)行加熱糊化，當(dāng)?shù)矸酆耆珪r(shí)，淀粉天然的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型結(jié)構(gòu)，此時(shí)淀粉更易被糖化酶水解。酶水解完成后，按斐林氏法測(cè)定還原糖含量，最后折算為淀粉含量。

1.3.2 檢測(cè)步驟

1.3.2.1 試樣酶水解

準(zhǔn)確稱(chēng)取大曲樣品5.0 g 于250 mL 三角瓶中，加入蒸餾水100 mL。樣品前處理采用高溫加熱，加快淀粉降解。待大曲溶液冷卻后，加入適量糖化酶（使用量按產(chǎn)品使用說(shuō)明添加），將三角瓶放于恒溫水浴鍋中，調(diào)節(jié)水溫至糖化酶的最適反應(yīng)溫度進(jìn)行糖化（大曲溶液pH 值接近于糖化酶的反應(yīng)pH 值）。糖化完成后（碘液驗(yàn)證），脫脂棉過(guò)濾至500 mL容量瓶，濾液搖勻并定容。

1.3.2.2 試樣測(cè)定

操作步驟同1.2.2.2。

2 結(jié)果與分析

為了比較兩種方法檢測(cè)大曲淀粉結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，將大曲樣品平均分成6 份，即為樣品1、樣品2……樣品6。采用兩種方法分別檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)2 次，并以各組數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值作為樣品的真實(shí)值。檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 大曲淀粉檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表 (%)

2.1 精密度的比較

精密度反映了重復(fù)檢測(cè)樣品時(shí)檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性，常用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)反映精密度的高低。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，說(shuō)明重復(fù)檢測(cè)結(jié)果間的誤差越小。兩種方法檢測(cè)6 個(gè)樣品結(jié)果的絕對(duì)偏差如圖1所示。

圖1 大曲淀粉檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)偏差對(duì)比圖

由圖1 可以看出，酶水解法檢測(cè)結(jié)果的絕對(duì)偏差低于酸水解法。其中酸水解法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.83 %，酶水解法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38 %，說(shuō)明酶水解法的精密度高于酸水解法。

2.2 準(zhǔn)確度的比較

準(zhǔn)確度是反映檢測(cè)結(jié)果接近于真實(shí)值的程度，常用相對(duì)誤差來(lái)表示準(zhǔn)確度的高低。相對(duì)誤差越小，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果越接近于真實(shí)值。兩種方法檢測(cè)6個(gè)樣品結(jié)果的相對(duì)誤差如圖2所示。

圖2 大曲淀粉檢測(cè)結(jié)果相對(duì)誤差對(duì)比圖

由圖2 可以看出，酶水解法檢測(cè)的6 組數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差比酸水解法低，說(shuō)明酶水解法的準(zhǔn)確度要高于酸水解法。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)驗(yàn)證

為進(jìn)一步考察酶水解法的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取3個(gè)大曲樣品，分別加入不等量的可溶性淀粉（烘干至恒重）做加標(biāo)回收試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2 可以看出，酶水解法檢測(cè)結(jié)果的平均回收率為93.94%±1.12%，表明此方法檢測(cè)大曲淀粉含量的準(zhǔn)確性較高。

表2 大曲淀粉回收結(jié)果對(duì)比表

2.4 實(shí)用性驗(yàn)證

由表1 可知，酸水解法測(cè)定的淀粉含量為59.16 %±1.08 %，酶水解法測(cè)定的淀粉含量為58.67 %±0.81 %，相差為0.49 %。為分析酶水解法與酸水解法在檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生的誤差是由偶然因素引起或是系統(tǒng)因素引起的,隨機(jī)選取10 個(gè)樣品，采用兩種方法分別檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 大曲淀粉檢測(cè)結(jié)果對(duì)比圖

由圖3 可以看出，酶水解法檢測(cè)結(jié)果與酸水解法檢測(cè)結(jié)果的誤差沒(méi)有規(guī)律性。為考察兩種方法檢測(cè)結(jié)果之間誤差的顯著性，采用MINITAB 軟件對(duì)10 組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果如表3所示。

從表3 可以看出，在0.05 水平上，兩種方法差值的顯著性結(jié)果P 值為0.541，大于0.05，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異性并不顯著，產(chǎn)生的誤差不是由方法本身帶來(lái)的。說(shuō)明酶水解法檢測(cè)大曲淀粉含量可以用于實(shí)際生產(chǎn)上的檢測(cè)應(yīng)用。

表3 差異顯著性分析結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)酸水解法和酶水解法在大曲淀粉檢測(cè)結(jié)果對(duì)比可以看出，在檢測(cè)精密度上，酶水解法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于酸水解法，檢測(cè)結(jié)果再現(xiàn)性更好；在檢測(cè)準(zhǔn)確度上，酶水解法相對(duì)誤差小于酸水解法。兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異性并不顯著，酶水解法不存在系統(tǒng)誤差。在實(shí)際生產(chǎn)中，酶水解法避免了強(qiáng)酸強(qiáng)堿的使用，符合現(xiàn)代環(huán)保檢測(cè)的要求，在檢測(cè)大曲淀粉含量應(yīng)用上具有重要的實(shí)用意義。