李杰玉，林玉玲，劉琳，金文波

（南陽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 南陽 473000）

胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms，GEP-NENs）是發(fā)生于消化系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，不同患者的臨床表現(xiàn)不同且預(yù)后較差[1]。 近年來，GEP-NENs 發(fā)病率逐年升高，患病早期無明顯癥狀，臨床主要采用影像學(xué)與內(nèi)鏡檢查等手段進(jìn)行診斷，但漏診率與誤診率較高，研究表明影像學(xué)與腫瘤特異性標(biāo)志物聯(lián)合檢測可提高GEP-NENs 的診斷準(zhǔn)確率[2-4]。 目前GEP-NENs 的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，因而積極探尋新型分子標(biāo)志物有助于提高GEP-NENs 的診斷效率及改善患者預(yù)后。 長鏈非編碼RNA 肝細(xì)胞核因子1 alpha 反義鏈1（long non-coding RNA hepatocyte nuclear factor 1 alpha-antisense 1，LncRNA HNF1A-AS1）在GEP-NENs 組織中的表達(dá)水平降低，并可能參與GEP-NENs 發(fā)生及發(fā)展過程[5]。 但HNF1AAS1 對GEP-NENs 的診斷價值尚未闡明。 目前已有研究證實LncRNA 如MEG3、PCAT1、SNHG16 等在血清中可以被檢測，并被認(rèn)為可作為腫瘤早期篩查的方法[6,7]。 而探索通過血液檢測是否能對GEP-NENs 進(jìn)行早期篩查或診斷，同時相較組織學(xué)檢測發(fā)揮簡單、快速、無侵襲性的優(yōu)勢具有重要臨床意義。 嗜鉻粒蛋白A (chromogranin A,CgA)在GEP-NENs 患者血清中表達(dá)水平升高，并可能作為診斷標(biāo)志物[8]。 但血清HNF1A-AS1 與CgA 水平對GEP-NENs 的診斷價值尚未可知。本研究通過檢測GEP-NENs 患者血清中HNF1A-AS1 與CgA 水平，分析其與患者臨床病理特征及其預(yù)后的相關(guān)性，探討二者聯(lián)合檢測對GEP-NENs 的診斷效能，旨在為尋找GEP-NENs 診斷及治療的有效標(biāo)志物提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月至2017年12月本院收集的GEP-NENs 患者70 例為GEP-NENs組，所有患者均經(jīng)病理檢查證實為GEP-NENs，收集患者臨床病理參數(shù)，包括年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤發(fā)生部位等，其中腫瘤分級診斷標(biāo)準(zhǔn)符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。 所有患者術(shù)前均進(jìn)行影像學(xué)診斷指標(biāo)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整者；依從性較差者。同時選取同期本院健康體檢中心的志愿者60 例為對照組。GEP-NENs 組患者中男56 例，女14 例，年齡46～68歲，平均年齡61.37±6.78歲。 對照組中男36 例,女24 例,年50～70歲，平均年齡63.37±7.16歲。 兩組患者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本 所有受試者均禁食12h，次日清晨抽取空腹靜脈血5ml 置于抗凝試管內(nèi)，4℃條件下經(jīng)3000r/min 轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清血清，置于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）檢測HNF1A-AS1 的表達(dá)水平 采用Trizol 法（美國Invitrogen 公司）提取血清中總RNA，利用紫外分光光度計（公司）測定RNA 濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司） 說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 HNF 1A-AS1 上游引物5’-TCAAGAAATGGTGGCTAT-3’，下游引物5’-GATCTGAGACTGGCTGAA-3’；GAPDH 上游引物5’-ACAGTCAGCCGCATCTTC TT-3’，下游引物5’-GACAAGCTTCCCT TCTCAG-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。 以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，嚴(yán)格按照熒光定量PCR 試劑盒（北京天根生化科技有限公司） 說明書進(jìn)行操作。 反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10μl, 上 下游引 物0.8μl，cDNA 1μl，ddH2O 補(bǔ)足體系至25μl。 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延 伸30s，共循環(huán)40 次。 HNF1A-AS1 以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HNF1A-AS1 的相對表達(dá)量。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中CgA水平 采用ELISA 檢測血清中CgA 水平，檢測試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 隨訪 采用電話、 門診復(fù)查等方式對所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪時間從患者經(jīng)病理組織檢查確診為GEP-NENs 開始，截止時間為2018年10月，統(tǒng)計患者總體生存率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS22.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析； 計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清HNF1A-AS1、CgA 水平對GEP-NENs 的診斷價值；采用Kaplan-Meier 對患者3年生存情況進(jìn)行分析；Cox 比例風(fēng)險模型 （cox proportional-hazards model） 分析影響患者預(yù)后的危險因素，各組數(shù)據(jù)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA HNF1A-AS1 與CgA 在GEP-NENs患者中的表達(dá)水平 與對照組相比，GEP-NENs 組患者血清中HNF1A-AS1 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），CgA 的水平顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 LncRNA HNF1A- AS1 與CgA 在GEP- NENs 患者中的表達(dá)水平（±s）

表1 LncRNA HNF1A- AS1 與CgA 在GEP- NENs 患者中的表達(dá)水平（±s）

組別對照組GEP-NENs 組n HNF1A-AS1 60 70 t P 1.00±0.10 0.46±0.11 29.091 0.000 CgA（μg/L）46.35±9.68 95.74±12.52 24.844 0.000

2.2 HNF1A-AS1、CgA 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性 根據(jù)HNF1A-AS1 與CgA 表達(dá)水平的平均值分別將患者分為HNF1A-AS1 高表達(dá)組30 例，低表達(dá)組40 例；CgA 高表達(dá)組45 例，低表達(dá)組25 例，觀察HNF1A-AS1、CgA 表達(dá)量與患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示HNF1AAS1、CgA 表達(dá)量與浸潤深度、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與年齡、性別、發(fā)生部位、腫瘤直徑無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表2 HNF1A- AS1、CgA 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性[例（%）]

2.3 血清HNF1A-AS1、CgA 水平對GEP-NENs 的診斷價值ROC 分析血清HNF1A-AS1、CgA 水平對GEP-NENs 的診斷價值，HNF1A-AS1 診斷時靈敏度為85.7%,特異度為50.0%,AUC 面積為0.644,95%CI：0.556～0.726，截斷值為0.908。 CgA 診斷時靈敏度為61.4%, 特異度為73.3%,AUC 面積為0.651，95%CI：0.563～0.733，截斷值為74.76。 聯(lián)合檢測時靈敏度為88.6%，特異度為90.0%，AUC 面積為0.945，95%CI：0.891～0.977，聯(lián)合檢測時靈敏度與特異度明顯高于各單項檢測，見圖1。

圖1 ROC 分析血清HNF1A- AS1、CgA 水平對GEP- NENs 的診斷價值

2.4 血清HNF1A-AS1、CgA 水平與GEP-NENs 患者預(yù)后的相關(guān)性Kaplan-Meier 分析顯示HNF1A-AS1 高表達(dá)組總體生存率（56.74%）高于低表達(dá)組（20.03%）（P ＜0.05）；CgA高表達(dá)組總體生存率（36.47%）低于低表達(dá)組（62.38%）（P＜0.05），見圖2。

圖2 血清HNF1A- AS1、CgA 水平與GEP- NENs 患者總生存率的相關(guān)性分析

2.5 影響GEP-NENs 患者預(yù)后的COX 分析 采用COX 比例風(fēng)險模型分析影響GEP-NENs 患者預(yù)后的相關(guān)因素，結(jié)果顯示高度腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HNF1A-AS1 表達(dá)量降低與CgA 水平升高是影響GEP-NENs 患者預(yù)后的危險因素（P＜0.05），見表3。

表3 影響GEP- NENs 患者預(yù)后的COX 分析

3 討論

LncRNA 在胃癌等多種腫瘤中異常表達(dá)并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明部分LncRNA還可作為腫瘤診斷的分子標(biāo)記物[10,11]。 因而探尋G EP-NENs 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的LncRNA 具有重要意義。

HNF1A-AS1 在膀胱癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)，沉默HNF1A-AS1 表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲[12,13]。 但相關(guān)報道指出HNF1A-AS1 在胃癌、胰腺癌等腫瘤組織中呈低表達(dá)，并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程[14,15]。 本研究結(jié)果顯示HNF1A-AS1 在GEP-NENs 患者血清中表達(dá)下調(diào)，與相關(guān)文獻(xiàn)報道相似。 提示HNF1A-AS1 表達(dá)量降低可能促進(jìn)GEP-NENs 的發(fā)生。 進(jìn)一步分析顯示HNF1A-AS1表達(dá)量降低與患者浸潤深度、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示隨著HNF1A-AS1 表達(dá)量降低患者疾病嚴(yán)重程度明顯增加。 本研究通過ROC 分析顯示HNF1A-AS1 對GEP-NENs 的靈敏度較高，但特異性較低。

CgA 是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒的重要成分，其在腫瘤中呈高表達(dá)并可作為神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，既往研究顯示CgA 表達(dá)水平升高可能促進(jìn)GEP-NENs 的發(fā)生，CgA 與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測可在一定程度上提高診斷效果[16-20]。 與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示CgA 在GEPNENs 患者血清中呈高表達(dá)，CgA 表達(dá)量與浸潤深度、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示血清CgA 水平升高可能促進(jìn)GEP-NENs 的發(fā)生及發(fā)展。 本研究結(jié)果顯示血清CgA 診斷GEP-NENs 的特異度明顯高于HNF1A-AS1，但靈敏度明顯低于HNF1AAS1，進(jìn)一步分析顯示聯(lián)合檢測時靈敏度與特異度明顯高于單獨檢測，提示HNF1A-AS1 與CgA 聯(lián)合檢測GEP-NENs 的診斷效能更佳。 同時本研究結(jié)果顯示HNF1A-AS1 表達(dá)量降低與CgA 水平升高時患者生存率降低，HNF1A-AS1 表達(dá)量升高與CgA 水平降低時患者生存率升高，提示血清HNF1A-AS1、CgA 水平與患者預(yù)后有關(guān)。 進(jìn)一步通過COX 分析顯示高度腫瘤分級、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HNF1A-AS1 表達(dá)量降低與CgA 水平升高是影響GEP-NENs 患者預(yù)后的危險因素。 提示HNF1AAS1 表達(dá)量降低與CgA 水平升高預(yù)示患者預(yù)后不良。

綜上所述，GEP-NENs 患者血清HNF1A-AS1表達(dá)顯著降低，CgA 顯著升高，且與患者臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，二者聯(lián)合檢測可提高對GEP-NENs 的診斷效能，可能成為GEP-NENs 治療的潛在靶點。