張?zhí)煜?，崔曉敏，孫鵬

（河南省安陽(yáng)市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 安陽(yáng) 455000）

腦血管畸形病是一種先天性的腦血管發(fā)育障礙或非腫瘤性發(fā)育異常性疾病，以年輕男性發(fā)病居多，會(huì)引起腦組織局部血管數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常，并且對(duì)正常腦血流產(chǎn)生影響，一旦發(fā)生血管破裂出血會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重腦出血或血腫，甚至危及生命[1]。腦血管畸形可以發(fā)生在大腦的任何部位,主要是腦實(shí)質(zhì)，也可以侵襲腦膜甚至頭皮，是引起外科腦血管意外的常見原因[2,3]。 分子生物學(xué)研究表明，腦血管畸形的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)涉及多種因素的多階段復(fù)雜過程，與遺傳、免疫等多種因素有關(guān)，在血管形成過程中細(xì)胞增殖周期調(diào)控失常能夠?qū)е卵艿漠惓０l(fā)育，導(dǎo)致血管畸形的形成。 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是具有最強(qiáng)的血管生成作用的細(xì)胞因子[4]，P16 是對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡具有調(diào)控作用的細(xì)胞因子，在新生血管形成及細(xì)胞增殖過程中，VEGF 及P16 具有極其重要的作用。 為進(jìn)一步探討腦血管畸形的發(fā)病機(jī)制，本次研究選取2017年1月至2019年3月在我院治療的腦血管畸形患者78 例，就其P16、VEGF 表達(dá)情況及其臨床意義進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年3月在我院治療的腦血管畸形患者78 例腦血管組織標(biāo)本（觀察組），其中動(dòng)靜脈畸形52 例，海綿狀血管瘤26 例；納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴在我院行手術(shù)治療，且經(jīng)病理組織學(xué)確診；⑵臨床資料完整；⑶患者年齡＞18歲。 排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并有惡性腫瘤、肝腎功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病等；⑵非初次治療者；⑶既往其它腦血管疾病病史。 同時(shí)選取其它疾病獲取的正常腦組織血管標(biāo)本30 份作為對(duì)照組，觀察組和對(duì)照組病例來(lái)源患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。 研究?jī)?nèi)容經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

表1 觀察組和對(duì)照組一般資料比較

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 血管組織VEGF 及P16 檢測(cè)采用免疫組化染色法，P16 單克隆抗體（克隆號(hào)：16P07,購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司），VEGF 單克隆抗體(克隆號(hào)JH121,福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。 標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定。 常規(guī)脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，3μm 連續(xù)切片，烘烤1h（70℃），烘烤片用二甲苯及乙醇脫蠟至水化后，所有切片用檸檬酸處理，用于高溫和高壓抗原修復(fù)。過氧化氫消除過氧化物酶，滴加山羊血清封閉抗原，溫育后加入1:50 稀釋的山羊單克隆抗體工作液（P16 克隆號(hào)41D，VEGF 克隆號(hào)44H），將加濕的盒子在室溫下溫育1h，用PBS 緩沖液沖洗后滴生物素標(biāo)記的二抗，室溫溫育，然后滴加生物素標(biāo)記的過氧化物酶后溫育。 DAB 顯示顏色，蘇木精復(fù)染核，中性膠密封。 為每批部分設(shè)置了明確的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷VEGF 主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，表現(xiàn)為淡黃色至棕黃色團(tuán)塊樣或顆粒樣染色物質(zhì)，P16 主要在血管內(nèi)皮胞漿及細(xì)胞核中表達(dá)，表現(xiàn)為淡黃色至棕黃色團(tuán)塊樣或顆粒樣染色物質(zhì)，采用半定量評(píng)價(jià)方法，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，對(duì)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)價(jià)，染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分；陽(yáng)性細(xì)胞比例＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，＞75%為4 分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例得分之和≥3 分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0 軟件，計(jì)量資料采用（±s)表示，比較使用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對(duì)照組P16、VEGF 表達(dá) 觀察組腦血管組織標(biāo)本P16、VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組腦血管組織標(biāo)本，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2 和圖1。

圖1 免疫組化染色圖

表2 觀察組和對(duì)照組P16、VEGF 表達(dá)

2.2 觀察組不同疾病患者P16、VEGF 表達(dá) 海綿狀血管瘤P16 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于動(dòng)靜脈畸形（P＜0.05）；海綿狀血管瘤和動(dòng)靜脈畸形VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表3。

表3 觀察組不同疾病患者P16、VEGF 表達(dá)

2.3 P16 與VEGF 在腦血管畸形標(biāo)本中的相互關(guān)系 相關(guān)分析結(jié)果顯示，在腦血管畸形組織標(biāo)本中，P16 與VEGF 表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表4。

表4 畸形腦血管組織中P16 與VEGF 表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

腦血管畸形是一種先天性血管疾病,可以發(fā)生在任何年齡，但在年輕男性中更常見。 腦血管畸形可以發(fā)生在大腦的任何部位，主要是腦實(shí)質(zhì)，也可以侵襲腦膜甚至頭皮[1]。 病變可以是單個(gè)或多個(gè),最常見于大腦半球的淺表部位, 其次是腦干和小腦。腦血管畸形有多種病理形式，以動(dòng)靜脈畸形最為常見[2]。 通常有一條或多條輸入動(dòng)脈和輸出靜脈，其中包含不同直徑、 不規(guī)則形狀和不同壁厚的血管，有些像動(dòng)脈，有些像靜脈，大多數(shù)位于大腦中動(dòng)脈的分布區(qū)，通常呈楔形，尖端指向大腦深處[6]。由于病變中的血流紊亂，血管痙攣或鄰近腦組織的血液循環(huán)的逐漸損傷或血管破裂，腦血管畸形可以是進(jìn)行性的或暴發(fā)性的[7]。 腦血管畸形臨床表現(xiàn)最常見的為畸形血管破裂的癥狀，部分患者以癲癇為首發(fā)癥狀，局部腦缺血可引起腦萎縮，智力下降，精神障礙等并發(fā)癥[8]。 早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和早期治療是降低患者死亡率、 嚴(yán)重不良并發(fā)癥和住院費(fèi)用的有效方法。 血管畸形的生存環(huán)境是一個(gè)動(dòng)態(tài)的分子生物環(huán)境。 通過研究畸形血管中分子因子和蛋白質(zhì)的變化,可以進(jìn)一步了解腦血管畸形的形成，發(fā)展和破裂的可能機(jī)制。 為醫(yī)務(wù)人員開發(fā)新的治療方法提供依據(jù),盡可能通過基因組學(xué)和化學(xué)改變病理血管的生理狀態(tài)，促進(jìn)血管修復(fù)，避免手術(shù)或栓塞等外傷性侵襲治療。 近年來(lái)，隨著顯微外科神經(jīng)外科和介入手術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，腦血管畸形的治療和預(yù)后有了明顯改善，但腦血管畸形和發(fā)病機(jī)制的原因尚不清楚。

P16 是腫瘤抑制基因編碼的蛋白質(zhì)，能夠?qū)?xì)胞的增殖及凋亡進(jìn)行調(diào)控，能夠調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過程從G1 到S 期[7]，P16 在體內(nèi)廣泛表達(dá)，在腦組織及腦血管的上皮細(xì)胞內(nèi)P16 的正常表達(dá)對(duì)于維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常增殖具有重要的意義[8,9]。在本組資料中，在動(dòng)靜脈畸形及海綿狀血管瘤組織中，P16 的表達(dá)上調(diào)，而且均要高于正常腦組織血管的表達(dá)水平，而腦血管畸形的發(fā)生與內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖有關(guān)，在內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖的過程中出現(xiàn)P16 的高表達(dá)，其可能是異常增殖導(dǎo)致的具有抑制增殖作用的P16 激活的結(jié)果。

VEGF 在血管的發(fā)生，發(fā)展和穩(wěn)定，增殖和變性中起重要作用。 VEGF 基因長(zhǎng)度為14kb,由7 個(gè)內(nèi)含子和8 個(gè)外顯子組成。 該產(chǎn)物是34～35kD 的同型二聚體蛋白質(zhì),并且亞基通過二硫鍵連接[10]。VEGF 產(chǎn)生五種轉(zhuǎn)錄因子，由23,121,165,189 和206 個(gè)氨基酸殘基組成。 研究表明，VEGF 是一種血管通透因子，以內(nèi)皮細(xì)胞為特異性靶點(diǎn)，引發(fā)一系列生理和病理生化變化，促進(jìn)細(xì)胞間隙的形成，并引起繼發(fā)性基質(zhì)蛋白酶降解[11]。 VEGF 啟動(dòng)并控制許多相關(guān)細(xì)胞因子和細(xì)胞在新血管形成過程中表達(dá)蛋白質(zhì)，促進(jìn)微血管發(fā)芽并影響增殖血管的成熟階段。 VEGF 是一種多功能因子，特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高親和力，可增加血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成[12]。 同時(shí)，血液中的纖維蛋白原和其他物質(zhì)可以進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)形成纖維蛋白凝膠，纖維蛋白凝膠作為基質(zhì)可以促進(jìn)新血管的形成和基質(zhì)細(xì)胞的增殖。 VEGF 主要的生物學(xué)功能是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有高度特異性，促進(jìn)血管生成和血管側(cè)支循環(huán)的建立[13]。 作為一種血管生成因子，VEGF可能在腦缺血再灌注中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)VEGF 在動(dòng)靜脈畸形中異常表達(dá)，這被認(rèn)為是由異常血流動(dòng)力學(xué)壓力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)引起的[14]。 可能的機(jī)制是隨著血管壓力的增加和異常血管中血流速度的加快，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的承壓損傷增加并逐漸惡化，而平滑肌細(xì)胞可以逐漸從舒張型變?yōu)榉置谛?，從而逐漸增加VEGF 的分泌，從而刺激內(nèi)皮細(xì)細(xì)胞的增殖，修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞層，同時(shí)促進(jìn)新生血管的增加，以補(bǔ)償血管壁損傷引起的缺血缺氧[15,16]。

本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，觀察組腦血管畸形患者血清VEGF 濃度明顯增高。 這表明腦血管畸形患者腦細(xì)胞缺血缺氧刺激局部組織釋放大量VEGF。 VEGF 的作用機(jī)制是與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特定受體結(jié)合，從而發(fā)揮其生物效應(yīng)，開放側(cè)支循環(huán)，改善腦供血功能。 隨著腦供血功能的不斷的改善，血清VEGF 水平也逐漸降低。

綜上所述，腦血管畸形血管標(biāo)本P16、VEGF表達(dá)明顯上調(diào)，兩者在疾病發(fā)生發(fā)展中可能通過相互調(diào)控促進(jìn)血管畸形的發(fā)生發(fā)展。