楊利，尚喜曉，王娟

（1.中原油田醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)中心菊?qǐng)@醫(yī)院大內(nèi)科，河南 濮陽 457331；2.濮陽市油田總醫(yī)院放療科，河南 濮陽 457001；3.濮陽市油田總醫(yī)院門診部，河南 濮陽 457001）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一種以侵蝕性滑膜炎為主要臨床特點(diǎn)的自身免疫性疾病，嚴(yán)重者甚至?xí)骗h(huán)軟骨和骨組織[1]。 目前RA的具體發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚，與自身免疫功能、遺傳、環(huán)境等多種因素有關(guān)[2]。 滑膜炎的發(fā)生與患者體內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平升高密切相關(guān)。 IL-27 屬新型的炎性細(xì)胞因子[3,4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤，感染性、自身免疫性疾病中白細(xì)胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）起著重要作用，B 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟蛋白1（B Lymphocyte Induced Maturation Protein 1,Blimp1）在B 細(xì)胞分化為漿細(xì)胞和漿細(xì)胞以分泌高水平的免疫球蛋白中起著關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[5]，與免疫系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，但是關(guān)于RA患者中Blimp1 和IL-27 的水平變化的報(bào)道很少。本研究目的是觀察RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中IL-27和Blimp1 mRNA 水平的變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年3月中原油田醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)中心菊?qǐng)@醫(yī)院治療的RA患者110 例為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）2009年修訂RA 分類標(biāo)準(zhǔn)；⑵近6 個(gè)月未接受過激素或免疫治療； ⑶患者及家屬知情同意。 排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴妊娠期或哺乳期婦女；⑵有混合結(jié)締組織病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；⑶合并有惡性腫瘤、肝腎功能障礙、甲狀腺疾病等。 同時(shí)選取健康志愿者100 例作為對(duì)照組，觀察組和對(duì)照組一般資料比較見表1。

表1 觀察組和對(duì)照組一般資料比較

1.2 檢測方法

1.2.1 熒光定量PCR 檢測兩組患者外周單個(gè)核細(xì)胞Blimp1 mRNA 水平 采集空腹靜脈血4ml，采用密度梯度離心法應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用Trol 法提取總RNA，用核酸蛋白分析儀進(jìn)行檢測，A260/280 值在1.8 ～2.0 之間，純度符合反轉(zhuǎn)錄要求；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)：BLIMP1, 上游引物序列：5’-ACACACGGGAGAAAAGCCA-3’，下游引物序列：5’-CTTGTGGCACTGGGAGCAC- 3’，內(nèi)參為GAPDH，上游引物序列：5’ - CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’, 下游引物序列：5’- CAAAGGTGGAGGAGTGGGTG – 3’，SYBR 反應(yīng)體系共20μl：cDNA2μl，上下游引物各1μl，Tap 酶混合物10μl，無RNA 酶水6μl。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，95 ℃15s，59 ℃1min，40 個(gè)循環(huán)。 相對(duì)表達(dá)量依據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算，每組重復(fù)3 次取平均值。

1.2.2 ELISA 法檢測血漿IL-21 水平 采集空腹靜脈血2ml，離心分析血漿，采用ELISA 法檢測血漿IL-21 水平，檢測儀器為ELX800 型酶標(biāo)儀（美國寶特公司），試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照試劑和儀器使用說明書進(jìn)行操作。

1.3 RA 活動(dòng)度判斷標(biāo)準(zhǔn) 疾病活動(dòng)判斷采用RA疾病活動(dòng)度評(píng)分28（DAS28）進(jìn)行評(píng)價(jià)[7],其中DA S28 積分＜3.2 分為低緩組，DAS28 積分3.2～5.1 分為中度活動(dòng)組，DAS28 積分＞5.1 分為高度活動(dòng)組。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0 軟件，IL-27 及Blimp1 mRNA 等資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較使用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 性別差異比較使用卡方檢驗(yàn)。 相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對(duì)照組PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表達(dá) 觀察組和對(duì)照組PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＞0.05），見表2。

表2 觀察組和對(duì)照組PBMCs 中IL- 27 及Blimp1 mRNA 表達(dá)

2.2 觀察組不同疾病活動(dòng)患者PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表達(dá) 高度活動(dòng)組PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于低緩組和中度活動(dòng)組（P＞0.05）； 中度活動(dòng)組PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于低緩組（P＞0.05）；見表3。

表3 觀察組不同疾病活動(dòng)患者PBMCs中IL- 27 及Blimp1 mRNA 表達(dá)

2.3 相關(guān)性分析 將觀察組PBMCs 中IL -27、Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與DAS28 積分進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：IL-27、Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與DAS28 積分呈正相關(guān)（r=0.246 和0.359，P＜0.05），見圖1。

圖1 相關(guān)分析圖

3 討論

RA 的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但近年來RA的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢，是影響我國居民健康和生活質(zhì)量的常見慢性病。 RA 以不可逆的骨及關(guān)節(jié)破壞為主要臨床表現(xiàn)，且病情反復(fù)加重，遷延不愈，最終引起骨關(guān)節(jié)的變性和功能障礙[8]。在RA 的發(fā)病過程中，骨及關(guān)節(jié)的通常以非細(xì)菌性炎性損害為主，在其發(fā)病及進(jìn)展過程中，炎性細(xì)胞因子發(fā)揮著重要的作用，諸如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等，均參與RA 的發(fā)病及病理改變的發(fā)生過程。

研究發(fā)現(xiàn)RA 的發(fā)生與T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞均有關(guān)，B 淋巴細(xì)胞可通過抗原遞送, 細(xì)胞因子的分泌和自身抗體的產(chǎn)生來促進(jìn)RA。 細(xì)胞因子在淋巴細(xì)胞活化和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，并參與RA 患者的滑膜炎癥過程[9],IL-27 是IL-12 超家族成員中的一員，參與自身免疫性疾病中的炎癥反應(yīng)，IL-27 具有免疫抑制和免疫促進(jìn)的雙重特征。 IL-27 衍生自具有不同來源和功能的不同細(xì)胞，目前認(rèn)為IL-27 主要由抗原呈遞細(xì)胞（AntigenPresenting Cell,APC）、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌[10]。 IL-27 與IL-27 受體復(fù)合物結(jié)合時(shí)才具有生物活性，Blimp1 基因位于人6 號(hào)染色體q21-q22中，在B 細(xì)胞分化為漿細(xì)胞中起著非常重要的作用，Blimp1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)免疫球蛋白的B 淋巴細(xì)胞分化和漿細(xì)胞分泌[11]，但關(guān)于其對(duì)自身免疫的研究很少。

本研究結(jié)果顯示，觀察組PBMCs 中IL-27 相對(duì)表達(dá)量分別高于對(duì)照組。 IL-27 主要由濾泡輔助T 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞及NKT細(xì)胞等CD4+T 細(xì)胞分泌，通過和IL-27R 結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)作用。 有報(bào)道稱[12,13]IL-27 可以使RA 患者的CD4+T 細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子發(fā)生活化，促使RA 患者生成破骨細(xì)胞。 進(jìn)而參與骨質(zhì)破壞以及誘導(dǎo)滑膜釋放基質(zhì)金屬蛋白酶參與關(guān)節(jié)病變。 在T 細(xì)胞分化的早期，IL-27 可以促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞向Thl 細(xì)胞分化，同時(shí)協(xié)同IL-12 促使T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，誘導(dǎo)Thl 細(xì)胞的促炎性作用。 有研究顯示，IL-27 在免疫抑制中擔(dān)當(dāng)了重要的角色，主要表現(xiàn)在Th17 細(xì)胞及其相關(guān)因子的抑制方面。 而已有實(shí)驗(yàn)表明Th17 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，由此可見，IL-27 也可能與RA 的發(fā)病有關(guān)。 趙芬等[14]通過RA 模型發(fā)現(xiàn)阻斷IL-27/IL-27R 通路能夠改善RA 病情。 IL-27 可促使RA 患者滑膜細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6 ，因此阻斷IL-27 有望成為治療RA 的有效途徑。

Blimp1 具有調(diào)節(jié)B 淋巴細(xì)胞分化的作用，RA是一種自身免疫性疾病，RA 發(fā)生時(shí)B 淋巴細(xì)胞會(huì)發(fā)生異常變化[15]，例如類風(fēng)濕因子和抗CCP 抗體異常升高，目前，很少有學(xué)者研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中Blimp1 的表達(dá)和IL-21 的調(diào)節(jié)情況。 本研究結(jié)果表明，RA 患者PBMCs 中Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，表明RA 患者PBMCs 中Blimp1 mRNA 表達(dá)上調(diào)，可能是由于B 細(xì)胞的增殖、分化，漿細(xì)胞特異表達(dá)抗原比例增加，標(biāo)記的漿細(xì)胞數(shù)增多，而Blimp1 于B 細(xì)胞向漿細(xì)胞分化過程有關(guān)，因此提示Blimp1 高表達(dá)促進(jìn)了自身免疫疾病的發(fā)生，可能與類風(fēng)濕的發(fā)病相關(guān)。

結(jié)果顯示： 隨著RA 病情的活動(dòng)，PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量組間增高，提示RA 活動(dòng)度大的患者，體內(nèi)炎癥反應(yīng)及免疫抑制強(qiáng)度越高，漿細(xì)胞表達(dá)越強(qiáng)烈，Blimp1 mRNA 水平越高，IL-27 可誘導(dǎo)未成熟的T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化，產(chǎn)生Th1 型反應(yīng)并促進(jìn)某些炎性因子的產(chǎn)生從而加重RA 炎癥反應(yīng)。 因此PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 表達(dá)量較活動(dòng)低度的患者多。 IL-27、Blimp1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與RA 活動(dòng)度呈正相關(guān)。 而且在相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)，RA 患者PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA。

本研究雖然取得了理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但也存在不足之處，本研究納入病例數(shù)較少，且都來自于我院，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定程度的偏倚，在今后的研究中需要擴(kuò)大樣本量。

綜上所述，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，兩者均與疾病活動(dòng)呈正相關(guān)，其可能與RA 的發(fā)病與進(jìn)展有關(guān)，可能通過相互調(diào)控共同參與RA 的發(fā)病及進(jìn)展過程。