楊利，尚喜曉，王娟

（1.中原油田醫(yī)療衛(wèi)生服務中心菊園醫(yī)院大內(nèi)科，河南 濮陽 457331；2.濮陽市油田總醫(yī)院放療科，河南 濮陽 457001；3.濮陽市油田總醫(yī)院門診部，河南 濮陽 457001）

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一種以侵蝕性滑膜炎為主要臨床特點的自身免疫性疾病，嚴重者甚至會破環(huán)軟骨和骨組織[1]。 目前RA的具體發(fā)生機制仍不完全清楚，與自身免疫功能、遺傳、環(huán)境等多種因素有關[2]。 滑膜炎的發(fā)生與患者體內(nèi)促炎細胞因子水平升高密切相關。 IL-27 屬新型的炎性細胞因子[3,4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤，感染性、自身免疫性疾病中白細胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）起著重要作用，B 淋巴細胞誘導的成熟蛋白1（B Lymphocyte Induced Maturation Protein 1,Blimp1）在B 細胞分化為漿細胞和漿細胞以分泌高水平的免疫球蛋白中起著關鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[5]，與免疫系統(tǒng)疾病密切相關，但是關于RA患者中Blimp1 和IL-27 的水平變化的報道很少。本研究目的是觀察RA 患者外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中IL-27和Blimp1 mRNA 水平的變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年3月中原油田醫(yī)療衛(wèi)生服務中心菊園醫(yī)院治療的RA患者110 例為觀察組，納入標準：⑴診斷符合美國風濕病學會（ACR）2009年修訂RA 分類標準；⑵近6 個月未接受過激素或免疫治療； ⑶患者及家屬知情同意。 排除標準：⑴妊娠期或哺乳期婦女；⑵有混合結締組織病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；⑶合并有惡性腫瘤、肝腎功能障礙、甲狀腺疾病等。 同時選取健康志愿者100 例作為對照組，觀察組和對照組一般資料比較見表1。

表1 觀察組和對照組一般資料比較

1.2 檢測方法

1.2.1 熒光定量PCR 檢測兩組患者外周單個核細胞Blimp1 mRNA 水平 采集空腹靜脈血4ml，采用密度梯度離心法應用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，采用Trol 法提取總RNA，用核酸蛋白分析儀進行檢測，A260/280 值在1.8 ～2.0 之間，純度符合反轉(zhuǎn)錄要求；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；實時熒光定量PCR 反應：BLIMP1, 上游引物序列：5’-ACACACGGGAGAAAAGCCA-3’，下游引物序列：5’-CTTGTGGCACTGGGAGCAC- 3’，內(nèi)參為GAPDH，上游引物序列：5’ - CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’, 下游引物序列：5’- CAAAGGTGGAGGAGTGGGTG – 3’，SYBR 反應體系共20μl：cDNA2μl，上下游引物各1μl，Tap 酶混合物10μl，無RNA 酶水6μl。反應條件為：95 ℃10 min，95 ℃15s，59 ℃1min，40 個循環(huán)。 相對表達量依據(jù)2-ΔΔCt計算，每組重復3 次取平均值。

1.2.2 ELISA 法檢測血漿IL-21 水平 采集空腹靜脈血2ml，離心分析血漿，采用ELISA 法檢測血漿IL-21 水平，檢測儀器為ELX800 型酶標儀（美國寶特公司），試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照試劑和儀器使用說明書進行操作。

1.3 RA 活動度判斷標準 疾病活動判斷采用RA疾病活動度評分28（DAS28）進行評價[7],其中DA S28 積分＜3.2 分為低緩組，DAS28 積分3.2～5.1 分為中度活動組，DAS28 積分＞5.1 分為高度活動組。1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0 軟件，IL-27 及Blimp1 mRNA 等資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較使用t 檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 性別差異比較使用卡方檢驗。 相關性采用Pearson 相關分析。 檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 觀察組和對照組PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表達 觀察組和對照組PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對表達量明顯高于對照組（P＞0.05），見表2。

表2 觀察組和對照組PBMCs 中IL- 27 及Blimp1 mRNA 表達

2.2 觀察組不同疾病活動患者PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表達 高度活動組PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對表達量明顯高于低緩組和中度活動組（P＞0.05）； 中度活動組PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對表達量明顯高于低緩組（P＞0.05）；見表3。

表3 觀察組不同疾病活動患者PBMCs中IL- 27 及Blimp1 mRNA 表達

2.3 相關性分析 將觀察組PBMCs 中IL -27、Blimp1 mRNA 相對表達量與DAS28 積分進行相關分析，結果顯示：IL-27、Blimp1 mRNA 相對表達量與DAS28 積分呈正相關（r=0.246 和0.359，P＜0.05），見圖1。

圖1 相關分析圖

3 討論

RA 的發(fā)病機制目前尚不明確，但近年來RA的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢，是影響我國居民健康和生活質(zhì)量的常見慢性病。 RA 以不可逆的骨及關節(jié)破壞為主要臨床表現(xiàn)，且病情反復加重，遷延不愈，最終引起骨關節(jié)的變性和功能障礙[8]。在RA 的發(fā)病過程中，骨及關節(jié)的通常以非細菌性炎性損害為主，在其發(fā)病及進展過程中，炎性細胞因子發(fā)揮著重要的作用，諸如腫瘤壞死因子、白細胞介素等，均參與RA 的發(fā)病及病理改變的發(fā)生過程。

研究發(fā)現(xiàn)RA 的發(fā)生與T 淋巴細胞和B 淋巴細胞均有關，B 淋巴細胞可通過抗原遞送, 細胞因子的分泌和自身抗體的產(chǎn)生來促進RA。 細胞因子在淋巴細胞活化和細胞間信號傳導中起重要作用，并參與RA 患者的滑膜炎癥過程[9],IL-27 是IL-12 超家族成員中的一員，參與自身免疫性疾病中的炎癥反應，IL-27 具有免疫抑制和免疫促進的雙重特征。 IL-27 衍生自具有不同來源和功能的不同細胞，目前認為IL-27 主要由抗原呈遞細胞（AntigenPresenting Cell,APC）、單核細胞、巨噬細胞等分泌[10]。 IL-27 與IL-27 受體復合物結合時才具有生物活性，Blimp1 基因位于人6 號染色體q21-q22中，在B 細胞分化為漿細胞中起著非常重要的作用，Blimp1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)免疫球蛋白的B 淋巴細胞分化和漿細胞分泌[11]，但關于其對自身免疫的研究很少。

本研究結果顯示，觀察組PBMCs 中IL-27 相對表達量分別高于對照組。 IL-27 主要由濾泡輔助T 細胞、Th17 細胞及NKT細胞等CD4+T 細胞分泌，通過和IL-27R 結合發(fā)揮相應生物學作用。 有報道稱[12,13]IL-27 可以使RA 患者的CD4+T 細胞和促炎性細胞因子發(fā)生活化，促使RA 患者生成破骨細胞。 進而參與骨質(zhì)破壞以及誘導滑膜釋放基質(zhì)金屬蛋白酶參與關節(jié)病變。 在T 細胞分化的早期，IL-27 可以促進CD4+T 細胞向Thl 細胞分化，同時協(xié)同IL-12 促使T 細胞產(chǎn)生IFN-γ，誘導Thl 細胞的促炎性作用。 有研究顯示，IL-27 在免疫抑制中擔當了重要的角色，主要表現(xiàn)在Th17 細胞及其相關因子的抑制方面。 而已有實驗表明Th17 細胞及其相關細胞因子參與了類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病，由此可見，IL-27 也可能與RA 的發(fā)病有關。 趙芬等[14]通過RA 模型發(fā)現(xiàn)阻斷IL-27/IL-27R 通路能夠改善RA 病情。 IL-27 可促使RA 患者滑膜細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6 ，因此阻斷IL-27 有望成為治療RA 的有效途徑。

Blimp1 具有調(diào)節(jié)B 淋巴細胞分化的作用，RA是一種自身免疫性疾病，RA 發(fā)生時B 淋巴細胞會發(fā)生異常變化[15]，例如類風濕因子和抗CCP 抗體異常升高，目前，很少有學者研究類風濕關節(jié)炎患者中Blimp1 的表達和IL-21 的調(diào)節(jié)情況。 本研究結果表明，RA 患者PBMCs 中Blimp1 mRNA 相對表達量高于對照組，表明RA 患者PBMCs 中Blimp1 mRNA 表達上調(diào)，可能是由于B 細胞的增殖、分化，漿細胞特異表達抗原比例增加，標記的漿細胞數(shù)增多，而Blimp1 于B 細胞向漿細胞分化過程有關，因此提示Blimp1 高表達促進了自身免疫疾病的發(fā)生，可能與類風濕的發(fā)病相關。

結果顯示： 隨著RA 病情的活動，PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 相對表達量組間增高，提示RA 活動度大的患者，體內(nèi)炎癥反應及免疫抑制強度越高，漿細胞表達越強烈，Blimp1 mRNA 水平越高，IL-27 可誘導未成熟的T 細胞向Th1 細胞分化，產(chǎn)生Th1 型反應并促進某些炎性因子的產(chǎn)生從而加重RA 炎癥反應。 因此PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA 表達量較活動低度的患者多。 IL-27、Blimp1 mRNA 相對表達量與RA 活動度呈正相關。 而且在相關分析中發(fā)現(xiàn)，RA 患者PBMCs 中IL-27、Blimp1 mRNA。

本研究雖然取得了理想的實驗結果，但也存在不足之處，本研究納入病例數(shù)較少，且都來自于我院，實驗結果可能存在一定程度的偏倚，在今后的研究中需要擴大樣本量。

綜上所述，類風濕關節(jié)炎患者PBMCs 中IL-27 及Blimp1 mRNA 表達明顯上調(diào)，兩者均與疾病活動呈正相關，其可能與RA 的發(fā)病與進展有關，可能通過相互調(diào)控共同參與RA 的發(fā)病及進展過程。