徐雙，李榮，馮君陽

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院婦科，河南 南陽 473000）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致我國(guó)女性死亡的常見惡性腫瘤之一。臨床上卵巢癌很難做到早期診斷，同時(shí)因其易發(fā)生腹腔種植轉(zhuǎn)移，60%以上的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于癌癥晚期，預(yù)后較差[1]。 盡管現(xiàn)階段卵巢的手術(shù)和化療方案已顯著發(fā)展，但卵巢癌的生存率仍較低，既往研究表明晚期卵巢癌患者5年生存率僅達(dá)30%左右[2]。 因此探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，可為卵巢癌的診斷、 治療以及預(yù)后評(píng)估提供理論基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義。 miRNA 是一種小分子非編碼RNA，多項(xiàng)研究表明miRNA 可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與調(diào)控腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程[3]。 目前針對(duì)卵巢癌相關(guān)研究多集中于miR-21、miR-141、miR-214 等分子表達(dá)，并證實(shí)了miRNA 對(duì)卵巢癌具有診斷意義。 miR-26b、miR-1182 均是miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，且已有研究表明在肝癌、 胃癌等疾病中具有重要調(diào)控作用[4,5]。 但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于miR-26b、miR-1182 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中是否存在異常表達(dá)、 以及與卵巢癌組織病理特征和預(yù)后關(guān)系的研究較為少見。 基于此，本研究分析miR-26b、miR-1182 在卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，以探討上述分子在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析本院2015年5月-2017年4月收治的85 例卵巢癌患者（惡性組）臨床資料。 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且經(jīng)病理學(xué)診斷確診；⑵既往未進(jìn)行放化療等治療；⑶臨床資料完整。 排除標(biāo)準(zhǔn)： ⑴合并其他惡性腫瘤者；⑵合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；⑶術(shù)后隨訪失訪者。另選取同期本院收治的良性上皮性卵巢腫瘤患者70 例（良性組）和來本院進(jìn)行檢查的健康人65 例（健康組）作為對(duì)照，其中良性組患者均經(jīng)病理學(xué)診斷確診，排除合并其他惡性腫瘤者；健康組為因子宮肌瘤而行正常卵巢切除者。 惡性組患者年齡32～70歲，平均54.85±4.67歲；病理類型：漿液性癌49 例、 粘液性癌25 例、 其他11 例；FIGO 臨床分期：Ⅰ期18 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期9 例；分化程度：低分化38 例，中分化29 例，高分化18例。 良性組年齡35～68歲，平均55.74±5.12歲；病理類型：漿液性囊腺瘤37 例,粘液性囊腺瘤33 例。健康組年齡30～70歲,平均54.18±5.83歲。 三組患者年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性（P＞0.05）。本次研究標(biāo)本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 檢測(cè)方法 儀器和試劑： 美國(guó)BIO-RED 公司生產(chǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀，天根生化科技公司生產(chǎn)的miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和總RNA 提取試劑盒、美國(guó)TheroFisher 公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀、 德國(guó)SIGMA 公司生產(chǎn)的低溫高速離心機(jī)和振蕩器等。

miR-26b、miR-1182 表達(dá)水平檢測(cè)：⑴總RNA提取：切取4 片厚度為10um 的石蠟標(biāo)本，加入1ml二甲苯并混勻，50℃水浴3min，離心2min，去掉二甲苯，上述操作重復(fù)1 次。 加入1ml 總RNA 提取試劑，15℃水浴5min，4℃12000rpm 離心10min，留取水相；加入等體積異丙醇，室溫靜置20min，4℃12000rpm 離心10min，去除上清液；加入1ml75%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃5000rpm 離心3min，留取下層沉淀；室溫靜置3min，加入50μl 去離子水，充分溶解RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其合格性。 將提取的RNA 于-70℃保存。 ⑵反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在冰浴的1.5mlEP 管內(nèi)置入miR-26b 或miR-1182 逆轉(zhuǎn)錄引物1ul、U6 逆轉(zhuǎn)錄引物1μl、dNTP2μl、RNA5μl、 去離子水加至14.5μl，混勻后離心，70℃水浴10min，冰浴2min，4℃靜置10min。 然后加入5×First-strand Buffer 4ul、RNasin0.5μl、TIAN Script M -MLV 1μl、 去離子水30μl，混勻后離心，42℃溫浴5min，95℃加熱5min 后終止反應(yīng)。 ⑶PCR 反應(yīng)：采用miRNA 特異性RT 引物對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，U6 引物、miR-26b 引物和miR-1182 引物序列見表1。 PCR反應(yīng)體系：5μl 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、1μl 的miR-1182/miR-26b 引物 或者U6 引 物，7.5μl 的H2O 以及10ul 的Sybr Green premix Ex taq。先在95℃下進(jìn)行預(yù)變性、 變性，然后調(diào)整溫度為60℃進(jìn)行退火延伸，時(shí)長(zhǎng)分別為30s、5s、30s，循環(huán)40 次，最后以72℃進(jìn)行延伸10min。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算均值。

表1 U6 引物、miR- 26b 引物和miR- 1182 引物序列

1.3 評(píng)估指標(biāo) 比較三組患者miR-26b、miR-1182水平，分析miR-26b、miR-1182 表達(dá)與卵巢癌組織病理特征關(guān)系；術(shù)后隨訪40 個(gè)月，根據(jù)患者預(yù)后情況將卵巢癌患者分為生存組和死亡組，比較兩組患者miR-26b、miR-1182 水平，并分析miR-26b、miR-1182 表達(dá)對(duì)于預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2或連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)； 計(jì)量資料以表示，多組間比較行單因素-方差分析，兩組間比較行t 檢驗(yàn)； 采用ROC 曲線分析miR-26b、miR-1182 表達(dá)對(duì)于預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者miR-26b、miR-1182 水平比較 惡性組患者miR-26b、miR-1182 水平均顯著低于良性組和健康組患者（P＜0.05）。 見表2。

表2 三組患者miR- 26b、miR- 1182 水平比較（±s）

表2 三組患者miR- 26b、miR- 1182 水平比較（±s）

組別 例數(shù)惡性組良性組健康組85 70 65 FP miR-26b 0.31±0.11 1.10±0.15 1.07±0.13 933.368＜0.001 miR-1182 0.68±0.21 2.95±0.35 3.02±0.32 1606.152＜0.001

2.2 miR-26b、miR-1182 表達(dá)與卵巢癌組織病理特征關(guān)系 不同年齡以及病理類型患者miR-26b、miR-1182 表達(dá)水平比較無顯著差異（P＞0.05），但不同分化程度以及FIGO 臨床分期患者miR-26b、miR-1182 表達(dá)水平存在顯著差異，具體表現(xiàn)為低分化＜中分化＜高分化，Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期＞Ⅳ期（P＜0.05）。 見表3。

表3 miR- 26b、miR- 1182 表達(dá)與卵巢癌組織病理特征關(guān)系（±s）

表3 miR- 26b、miR- 1182 表達(dá)與卵巢癌組織病理特征關(guān)系（±s）

病理特征 例數(shù) miR- 1182 t/F P年齡t/F P 0.822 0.413 0.438 0.662病理類型＜50歲≥50歲漿液性癌粘液性癌其他3.093 0.051 0.251 0.779分化程度37.090＜0.001 34.389 57.8＜0.001 17.85 FIGO 臨床分期低中高Ⅰ期30.801＜0.001 27.177＜0.001Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期47 38 49 25 11 38 29 18 18 30 28 9 miR- 26b 0.30±0.12 0.32±0.10 0.37±0.13 0.33±0.12 0.27±0.12 0.20±0.09 0.36±0.12 0.46±0.14 0.48±0.14 0.36±0.12 0.20±0.09 0.15±0.08 0.67±0.23 0.69±0.18 0.69±0.19 0.68±0.25 0.64±0.21 0.41±0.15 0.73±0.21 1.23±0.34 0.96±0.29 0.78±0.24 0.52±0.15 0.28±0.13

2.3 miR-26b、miR-1182 表達(dá)分別于FIGO 臨床分期、分化程度的相關(guān)性 miR-26b 表達(dá)與分化程度呈正相關(guān)（r=0.784），與FIGO 臨床分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.757）；miR-1182 表達(dá)與分化程度呈正相關(guān)（r=0.860），與FIGO 臨床分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.776）（P 均＜0.05）。 見圖1-4。

圖1 miR- 26b 表達(dá)與分化程度關(guān)系

2.4 不同預(yù)后患者miR-26b、miR-1182 水平比較生存組患者miR-26b、miR-1182 水平均顯著高于死亡組患者（P＜0.05）。 見表4。

表4 不同預(yù)后患者miR- 26b、miR- 1182 水平比較（±s）

表4 不同預(yù)后患者miR- 26b、miR- 1182 水平比較（±s）

組別 例數(shù)生存組死亡組52 33 t P miR-26b 0.39±0.13 0.18±0.08 8.323＜0.001 miR-1182 0.91±0.27 0.32±0.11 11.920＜0.001

圖2 miR- 1182 表達(dá)與分化程度關(guān)系

圖3 miR- 26b 表達(dá)與臨床分期關(guān)系

圖4 miR- 1182 表達(dá)與臨床分期關(guān)系

2.5 miR-26b、miR-1182 表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 miR-26b 和miR-1182 預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC 曲線下面積分別為0.918、0.982，其中miR-26b 的特異度為90.90%，敏感度為80.80%；miR-1182 的特異度為97.00%，敏感度為94.20%，miR-26b 和miR-1182 表達(dá)均對(duì)卵巢癌患者預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值（P＜0.05）。 見圖5。

圖5 miR- 26b、miR- 1182 表達(dá)預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC 曲線

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，卵巢癌發(fā)病率逐年上升，且趨于年輕化，現(xiàn)已成為導(dǎo)致婦科惡性腫瘤死亡的首要原因[7]。 卵巢腫瘤因增長(zhǎng)緩慢，且卵巢位于盆腔深處，缺乏特異性的癥狀以及有效的早期診斷方法，導(dǎo)致部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，失去治療機(jī)會(huì)。 但臨床實(shí)踐表明早期發(fā)現(xiàn)和治療可提高患者生存率。 故闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并尋求有效的早期診斷指標(biāo)是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。 miRNA 在卵巢癌的研究尚處于初級(jí)階段，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA 在卵巢癌組織中存在異常表達(dá)，由于miRNA 具有靶向基因的反向調(diào)控功能，廣泛參與到細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的調(diào)控中[8]。因此，研究miRNA 在腫瘤組織中的表達(dá)對(duì)于診斷以及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床意義。

miR-26b、miR-1182 均屬于miRNA 家族，研究發(fā)現(xiàn)miR-26b、miR-1182 在前列腺癌、肺癌等惡性中腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均具有重要調(diào)節(jié)作用，且在上述癌組織中表達(dá)情況往往下調(diào),可能具有抑癌基因作用[9,10]。 然而，關(guān)于miR-26b、miR-1182 對(duì)卵巢癌的作用研究并不多見。 在本研究中，通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法對(duì)卵巢癌組織、 良性卵巢腫瘤組織以及正常卵巢組織的miR-26b、miR-1182 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示卵巢癌組織中的miR-26b、miR-1182 表達(dá)水平相比于正常以及良性卵巢組織均明顯下調(diào)，提示卵巢癌中miR-26b、miR-1182 表達(dá)存在失調(diào)，可能作為抑癌因子參與了卵巢癌的發(fā)生。 李勵(lì)[11]、李維[12]等人研究也有此結(jié)論，與本研究結(jié)果相一致。 進(jìn)一步分析miR-26b、miR-1182 表達(dá)與卵巢癌病理組織特征的關(guān)系，結(jié)果顯示不同分化程度以及FIGO 臨床分期患者miR-26b、miR-1182 表達(dá)水平存在顯著差異，具體表現(xiàn)為低分化＜中分化＜高分化,Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期＞Ⅳ期,提示miR-26b、miR-1182 在卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化中也起到重要作用。 分析其原因，Lin J[13]等人通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-26b 可下調(diào)OCT4、波形蛋白并上調(diào)E-鈣粘蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期阻滯；miR-26b 可通過與靶基因互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，或者對(duì)靶蛋白的翻譯過程產(chǎn)生抑制作用,從而參與到癌細(xì)胞的分化、增殖等病理過程中。 Hou XS[14]等人通過體外實(shí)驗(yàn)表明miR-1182 與hTHRT 表達(dá)在卵巢癌組織中存在相關(guān)性，而hTHRT 及其下游信號(hào)分子激活是導(dǎo)致卵巢癌發(fā)展的重要機(jī)制, 故推測(cè)miR-1182可能通過靶向調(diào)節(jié)hTHRT，導(dǎo)致其下游信號(hào)通路改變，從而來發(fā)揮對(duì)卵巢癌增殖、 侵襲能力的調(diào)控。 國(guó)內(nèi)部分學(xué)者研究也表明miR-26b、miR-1182表達(dá)與卵巢癌患者的臨床分期、 分化程度具有一定關(guān)系[12,15],但本研究在此基礎(chǔ)上通過spearman 相關(guān)性深入分析，發(fā)現(xiàn)iR-26b、miR-1182 表達(dá)均與分化程度呈正相關(guān)，與FIGO 臨床分期呈負(fù)相關(guān)。此外，本研究根據(jù)術(shù)后隨訪結(jié)果對(duì)不同預(yù)后患者miR-26b、miR-1182 表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示miR-26b 和miR-1182 預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC 曲線下面積分別為0.918、0.982，其中miR-26b 的特異度為90.90%，敏感度為80.80%；miR-1182 的特異度為97.00%，敏感度為94.20%，提示miR-26b、miR-1182 低表達(dá)對(duì)于卵巢癌患者預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，這也是本研究的創(chuàng)新之處。

綜上所述，miR-26b、miR-1182 在卵巢癌組織中明顯低表達(dá)，且與癌組織的臨床分期、分化程度以及預(yù)后密切相關(guān)，有望成為卵巢癌早期診斷以及預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。