張春燕，王秀敏

（1.安陽市人民醫(yī)院護理部；2.安陽市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 安陽 455000）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，而且中國人群食道癌發(fā)病率顯著高于世界平均水平。 食管癌具有兩種病理分型，其中約80%患者為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC），20%患者為食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。 盡管手術(shù)治療和放、化療在一定程度上延長了食管癌患者的生存期，但由于癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)依然影響食管癌預(yù)后的重要因素[1,2]。啟膈散主治噎膈、吞咽困難，臨床研究發(fā)現(xiàn)，啟膈散在防治食管癌癌前病變、 改善中晚期患者生存質(zhì)量方面具有一定功效[3-5]，然而其有效成分及作用機制還沒有深入的研究。 腫瘤細胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強侵襲和轉(zhuǎn)移能力，因此抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程對防治腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有重要意義。本研究通過建立體外培養(yǎng)的食管癌細胞系Eca109上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型，探究了啟膈散對食管癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機制。

1 材料和方法

1.1 藥物 沙參15g，丹參15g，荷葉蒂15g，茯苓15g，川貝母6g，郁金10g，砂仁殼3g，加入1000ml水加熱煮沸煎制。 中藥煎出液經(jīng)離心去除藥渣，上清放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，40℃蒸發(fā)濃縮。 隨后將濃縮液轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱冷凍過夜，后于凍干機中制備凍干粉，稱量后分裝保存。 使用前，用DMEM 培養(yǎng)基溶解配置成5mg/ml 的母液，經(jīng)過0.22μm 濾器過濾除菌，放置于4℃保存。

1.2 主要試劑和耗材 DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國GE 健康公司）、胎牛血清（美國Gibco 公司）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（美國Gibco 公司）、CCK-8 細胞活性試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）、細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板（美國康寧公司）、Transwell 小室（美國BD 公司）、小鼠抗E-鈣粘蛋白抗體和小鼠抗N-鈣粘蛋白抗體（美國Abcam 公司）、小鼠抗波形蛋白抗體（美國CST 公司）、 兔抗GAPDH 抗體（美國Santa Cruz 公司）、HRP 偶聯(lián)抗小鼠IgG 抗體和抗兔IgG 抗體（天津三箭生物公司）、TriZOL 總RNA提取試劑（美國ThermoFisher 公司）、qPCR super Mix（美國Roche 公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)和處理 人食管鱗癌細胞系ECA109購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞庫。 細胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，于二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。 加藥處理時，將ECA109 細胞分為4 組，其中對照組不加入啟膈散，其余三組分別加入終濃度50、100、200μg/ml 的啟膈散，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.4 CCK-8 實驗檢測細胞增殖活性 消化離心收集傳代培養(yǎng)的ECA109 細胞，使用DMEM 完全重懸細胞并計數(shù)后，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔5×104個細胞，每組設(shè)置3 個復(fù)孔平行對照。 在加入啟膈散后的第0 h、24 h、48 h 時，加入10μl CCK-8檢測液，繼續(xù)置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，使用酶標儀讀取450 nm 波長的吸光值。

1.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移能力 消化并用無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸ECA109 細胞，將細胞密度調(diào)整為1×106個/mL。 取200μl 細胞懸液，加入到Transwell 上層小室中，并將小室放置于24 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板每孔加入600μl 完全培養(yǎng)基。將Transwell 裝置放置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后取出Transwell 裝置，放置于4%多聚甲醛溶液中固定15 min，然后使用PBS 清洗3 次，每次5min。 用棉簽擦拭小室內(nèi)未遷移的細胞，使用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色20 min，用PBS 充分清洗去掉浮色。 將Transwell 小室薄膜取下，使用明場顯微鏡拍照，并計算視野中發(fā)生遷移的細胞數(shù)。 拍照后，將薄膜浸泡于10%乙酸溶液中抽提10 min，使用酶標儀檢測抽提液590 nm 波長的吸光值，并計算相對遷移率。

1.6 總RNA 提取及Real-time PCR 檢測 不同濃度啟膈散處理的Eca109 細胞經(jīng)過消化并離心，使用磷酸鹽緩沖液清洗一遍，加入500μl TriZOL 試劑裂解，隨后加入氯仿抽提RNA，并用異丙醇沉淀并洗滌，得到的總RNA 用DEPC 處理的ddH2O 溶解得到1 μg/μl。 隨后使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA 合成。 取1μg 總RNA，加入oligo dT 引物，65℃變性5 min，后立刻冰浴退火2 min。 隨后在反應(yīng)體系中加入dNTPs、M-MLV、 核酸酶抑制劑等，放置在42℃金屬加熱器中反應(yīng)30 min。 隨后使用實時熒光定量PCR Mix 進行目的基因mRNA 表達水平的檢測，通過ΔΔCt 法計算基因相對表達水平，所用引物序列為，見表1。

表1 引物序列信息

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 使用細胞裂解液重懸Eca109 細胞，放置于冰上裂解30 min。 12000 rpm離心10 min，上清加入SDS 上樣緩沖液沸水浴加熱10 min。 隨后使用SDS-PAGE 電泳蛋白樣品，使用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白樣品轉(zhuǎn)印在尼龍膜上。 使用封閉液孵育30 min，然后分別加入稀釋后的一抗，室溫孵育60 min，使用TBST 溶液漂洗3 次，每次5 min，加入二抗室溫孵育45 min，隨后使用TBST 溶液漂洗5 次，每次5 min。 最后加入發(fā)光底物，用凝膠成像儀拍攝蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計分析 采用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示。采用t test 分析組間差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度啟膈散對細胞增殖活性的影響 實驗結(jié)果表明啟膈散在50 μg/ml、100 μg/ml 作用濃度時對未對細胞增殖活性產(chǎn)生明顯影響（50 μg/ml組：t = 0.5196，P =0.6308；t =0.5203，P =0.6303；t =1.514 P=0.2046；100 μg/ml 組：t=1.109，P=0.3297；t= 0.3464，P=0.7465；t= 0.4856，P=0.6526），而當啟膈散作用濃度增加到200μg/ml，在作用24 h、48 h和72 h 后，顯著抑制了Eca109 細胞的增殖活性（24 h: t=3.122，P=0.0354；48 h: t=4.102，P=0.0148；72 h: t=5.042,P=0.0073），見表2。

表2 啟膈散處理后各組細胞相對增殖活性

2.2 不同濃度啟膈散對細胞遷移的影響 實驗結(jié)果表明，見圖2，50μg/ml 啟膈散對細胞遷移能力沒有明顯影響，而將啟膈散濃度提高到100μg/ml 或200μg/ml 時，遷移到下層小室的細胞明顯減少（50μg/ml 組：t =0.753,P =0.4934；100μg/ml 組：t =2.817,P=0.048；200μg/ml 組：t=6.353,P=0.0031），見圖2，通過定量統(tǒng)計相對細胞遷移率發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，100μg/ml 和200μg/ml 啟膈散處理組相對細胞遷移率均顯著下降（50μg/ml 組：t=0.723,P=0.5097；100μg/ml 組：t =3.49,P =0.0251；200μg/ml組：t=4.153,P=0.0142），見圖3,且啟膈散對細胞遷移的抑制作用隨濃度升高而增加。

圖2 遷移到下層小室的細胞數(shù)

圖3 各組細胞相對遷移率

圖1 結(jié)晶紫染色標記遷移到下層小室的細胞。

2.3 Real-time PCR 檢測Eca109 細胞E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 的mRNA 表達水平 實驗結(jié)果表明，50μg/ml 濃度的啟膈散對Eca109 細胞中N-cadherin、E-cadherin 和Vimentin 蛋白mRNA的表達未產(chǎn)生顯著影響,但啟膈散作用濃度增加到100μg/ml 或200μg/ml 后，Eca109 細胞中N-cadherin（50μg/ml 組：t=1.076,P=0.3427；100μg/ml 組：t=6.023,P=0.0038；200μg/ml 組：t=5.573,P=0.0051）和Vimentin（50μg/ml 組：t=1.315,P=0.2590；100μg/mL 組：t=6.185,P=0.0035；200μg/ml 組：t=7.907,P=0.0014）mRNA 表達水平顯著下降，而E-cadherin（50μg/ml 組：t =1.033,P =0.3601；100μg/ml 組：t =3.361,P=0.0283；200μg/ml 組：t=3.366,P=0.0281）蛋白mRNA 表達水平顯著上升，見圖4。

圖4 不同濃度啟膈散處理的Eca109 細胞中N- cadherin、E- cadherin 和Vimentin 蛋白mRNA 的相對表達水平

2.4 Western blot 實驗檢測上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標記分子蛋白蛋白表達水平 實驗結(jié)果表明，50μg/ml 濃度的啟膈散抑制了N-cadherin 蛋白水平的表達，但對E-cadherin 和Vimentin 蛋白水平的表達未產(chǎn)生顯著影響，而當啟膈散作用濃度增加到100μg/ml 或200μg/ml 后，E-cadherin 蛋白水平的表達顯著上升，而N-cadherin 和Vimentin 蛋白的表達水平顯著下降，見圖5。

圖5 不同濃度啟膈散處理的Eca109 細胞中N- cadherin、E- cadherin 和Vimentin 蛋白相對表達水平

3 討論

當前，食管癌治療的主要方法是手術(shù)結(jié)合放化療，但由于食管癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，常導(dǎo)致患者術(shù)后復(fù)發(fā)，影響生存率。 啟膈散出自清代中醫(yī)著作《醫(yī)學(xué)心悟》，主治 “噎嗝”，而食管癌部分臨床癥狀如吞咽困難等于 “噎嗝” 相似[6]。 傳統(tǒng)中醫(yī)理論，陰虛、氣郁、痰氣交阻是食管癌發(fā)病的病機，而李晶等提出 “血液衰耗，胃脘干槁” 是其核心病機[3]。啟膈散具有滋陰、潤燥、解郁、化痰之功效[6]，近幾十年了被廣泛接受作為食管癌的中醫(yī)治療方案，并取得了較為明顯的療效[3-5]。 此外，啟膈散也可與化療藥物如順鉑、 紫杉醇等聯(lián)合用藥改善了食管癌的治療預(yù)后[7,8]。史會娟等發(fā)現(xiàn)啟膈散可以影響食管癌細胞骨架的重排[9]；吳耀松等和尹素改等分別發(fā)現(xiàn)啟膈散會通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子STAT3 抑制食管癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[10,11]。 然而，啟膈散中的有效作用成分及其參與食管癌疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制還不是很清楚[12]。

食管癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT） 在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用[13]。 在腫瘤細胞EMT 的過程中，細胞由連接緊密的上皮樣細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣細胞，上皮細胞粘附分子E-cadherin 表達水平下調(diào)，而非上皮細胞粘附分子N-cadherin 表達水平上升，細胞粘附能力減弱，而遷移能力增強[14]。 EMT過程中另一個標記分子Vimentin 屬于細胞骨架組分III 型中間絲，可以被轉(zhuǎn)錄因子Smad 激活表達，在EMT 過程中表達水平上升[15,16]。 本研究中，我們發(fā)現(xiàn)使用不同濃度的啟膈散均會引起N-cadherin、Vimentin 蛋白及mRNA 表達水平的下降，以及Ecadherin 蛋白及mRNA 表達水平的上升，且隨著啟膈散濃度的升高其表達水平變化更顯著，該結(jié)果提示啟膈散可以抑制食管癌細胞系Eca109 的EMT 過程。 與此相一致的是，通過Transwell 實驗檢測發(fā)現(xiàn)加入不同濃度啟膈散也會抑制Eca109細胞的遷移能力，且啟膈散的抑制作用具有劑量依賴效應(yīng)。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了啟膈散可以通過抑制食管癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響細胞的遷移。