楊慶華 楊隆良 楊曉莉

阿爾茨海默病(AD)是一種常見于老年人的復(fù)雜中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性退行性疾病，表現(xiàn)為記憶喪失、認(rèn)知和行為功能的永久性損害以及各種精神障礙，是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因。隨著全球人口老齡化發(fā)展，AD發(fā)病率逐年增加，已成為一種普遍的健康問題[1]。由于對(duì)AD發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制認(rèn)識(shí)有限，目前臨床仍缺乏有效方法來阻止或延緩疾病進(jìn)展。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)作為表達(dá)遺傳調(diào)控分子通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種方式發(fā)揮生物活性，參與調(diào)控細(xì)胞存活、凋亡、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等多種病理生理過程，在包括AD在內(nèi)的等多種神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮作用[2,3]。研究顯示lncRNA Gm4419在糖尿病腎病中表達(dá)上調(diào)，敲低其表達(dá)可抑制炎性反應(yīng)[4]。Gm4419通過激活NF-κB信號(hào)上調(diào)趨化素表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)高血壓性腦動(dòng)脈硬化惡化[5]。然而Gm4419在AD進(jìn)展中的作用和分子機(jī)制并不清楚。miR-703是一種心肌梗死保護(hù)性miRNA，研究顯示miR-703通過抑制心肌細(xì)胞焦亡保護(hù)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[6]。序列分析發(fā)現(xiàn)miR-703是Gm4419的潛在靶基因，但Gm4419是否靶向miR-703參與AD進(jìn)展尚未有研究。β-淀粉樣肽25-35(Aβ25-35)是一種短分子片段，具有全長(zhǎng)肽的毒性，其誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷在AD體外研究中已廣泛應(yīng)用[7,8]。因此，本研究重點(diǎn)探討Gm4419和miR-703對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響，分析二者靶向調(diào)控關(guān)系，以期為防治AD提供有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Aβ25-35(取適量Aβ25-35溶于無菌三蒸水中制成1 mmol/L儲(chǔ)存液，-20℃冰箱避光保存?zhèn)溆?購于上海樊克生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR green master mix購于大連寶生物公司；小干擾RNA(si-RNA)、miRNA模擬物(mimics)、miRNA抑制物(anti-miR)、過表達(dá)載體(pcDNA-RNA)由廣州復(fù)能基因公司提供；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購于北京博奧森生物；兔源B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)抗體、兔源Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購于上海碧云天生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇PC12細(xì)胞后，將其接種在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換1次培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前1 d用含50 μg/L的神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)PC12分化使其具有神經(jīng)細(xì)胞特性。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(Con組)為未經(jīng)任何處理的PC12細(xì)胞；Aβ25-35組為用含40 μmol/L培養(yǎng)液孵育PC12細(xì)胞48 h[9]；Aβ25-35+si-NC組、Aβ25-35+si-Gm4419組、Aβ25-35+miR-NC組、Aβ25-35+miR-703組為將si-NC、si-Gm4419、miR-NC、miR-703 mimics分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h；Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC組、Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-703組為將si-Gm4419+anti-miR-NC、si-Gm4419+anti-miR-703分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染為采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞進(jìn)行Aβ25-35處理。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)分析Gm4419和miR-703表達(dá)量:按照Trizol試劑使用說明書提取各組PC12細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)法測(cè)定其濃度后置于-80℃冰箱保存。利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用SYBR green master mix進(jìn)行RT-qPCR。Gm4419和miR-703表達(dá)量以2-ΔΔCT法計(jì)算。Gm4419上游引物5’-GGAACCA AGCAGACCGAAGAC-3’，下游引物5’-CCC CAACCCACAGGAACATAA-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’，下游引物5’-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3’。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:收獲各組PC12細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中，分別加入加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻后暗室孵育15 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.5 蛋白質(zhì)印記法(western blot)檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量:放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)緩沖液提取各組PC12細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后，將適量蛋白與等體積上樣緩沖液混合煮沸3 min變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。膜封閉后，4℃下用抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體孵育膜過夜。室溫下再用二抗孵育膜2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影、定影，曝光后，采用Image J軟件分析各條帶灰度值，目的蛋白表達(dá)量以對(duì)應(yīng)蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測(cè)SOD活性、MDA含量:收集各組PC12細(xì)胞至離心管內(nèi)，離心(1 000 g)10 min棄上清液，加入提取液超聲破碎細(xì)胞，4℃下離心(8 000 g)10 min獲得上清液，置于冰上備用。隨后按照試劑盒步驟測(cè)定SOD活性以及MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):將含有miR-703結(jié)合位點(diǎn)序列的Gm4419野生序列或Gm4419突變序列分別克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建野生型或突變型熒光素酶報(bào)告載體WT-Gm4419或MUT-Gm4419。將WT-Gm4419、MUT-Gm4419分別與miR-703 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)裂解細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性。同時(shí)將pcDNA、pcDNA-Gm4419、si-NC、si-Gm4419分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-703表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中的表達(dá) Aβ25-35組PC12細(xì)胞Gm4419表達(dá)量顯著高于Con組(P<0.05)，miR-703表達(dá)量顯著低于Con組(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2 抑制lncRNA Gm4419表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，Aβ25-35組PC12細(xì)胞Gm4419表達(dá)量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與Aβ25-35+si-NC組比較，Aβ25-35+si-Gm4419組PC12細(xì)胞Gm4419表達(dá)量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制lncRNA Gm4419表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響;A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表2 抑制lncRNA Gm4419表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

2.3 miR-703過表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響 與Aβ25-35+miR-NC組比較，Aβ25-35+miR-703組PC12細(xì)胞miR-703表達(dá)量、SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-703過表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響;A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表3 miR-703過表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

2.4 lncRNA Gm4419靶向調(diào)控miR-703的表達(dá) LncBase Predicted v.2在線分析顯示Gm4419與miR-703存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。miR-703 mimics和WT-Gm4419共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-Gm4419共轉(zhuǎn)染顯著降低(P<0.05)，而miR-703 mimics和MUT-Gm4419共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性與miR-NC和MUT-Gm4419共轉(zhuǎn)染比較無顯著變化。pcDNA-Gm4419組細(xì)胞中miR-703表達(dá)量較pcDNA組顯著降低(P<0.05)，而si-Gm4419組細(xì)胞中miR-703表達(dá)量較si-NC組顯著升高(P<0.05)。見表4、5，圖3。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 抑制miR-703表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA Gm4419抑制

表5 lncRNA Gm4419調(diào)控miR-703的表達(dá)

圖3 lncRNA Gm4419的序列中含有與miR-703互補(bǔ)的核苷酸序列

對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用 與Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC組比較，Aβ25-35+si-Gm4419+ anti-miR-703組PC12細(xì)胞miR-703表達(dá)量、SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著升高(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 干擾miR-703表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA Gm4419表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用

圖4 干擾miR-703表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA Gm4419表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用；A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

3 討論

AD可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和大腦認(rèn)知能力退化，是老年癡呆癥發(fā)生的最主要原因。近年來。多項(xiàng)研究證實(shí)lncRNA參與了AD相關(guān)病理過程。如lncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)在Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)增加，下調(diào)其表達(dá)減弱Aβ25-35對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用，并促進(jìn)神經(jīng)元凋亡、增加Tau蛋白磷酸化水平[10]。上調(diào)lncRNA母系表達(dá)基因3(MEG3)可改善AD大鼠認(rèn)知障礙，減輕神經(jīng)損傷，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎性反應(yīng)[11]。本研究中Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12損傷后Gm4419表達(dá)水平升高提示Gm4419表達(dá)改變可能與AD患者神經(jīng)元損傷。轉(zhuǎn)染si-Gm4419進(jìn)行功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，抑制Gm4419表達(dá)顯著減弱Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。與本研究發(fā)現(xiàn)類似，抑制Gm4419表達(dá)可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的肝或心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)肝或心肌缺血再灌注損傷[12,13]。Bcl-2和Bax蛋白是線粒體凋亡途徑的作用調(diào)節(jié)因子，Bax移位導(dǎo)致線粒體通透性增加促進(jìn)細(xì)胞色素c等蛋白釋放進(jìn)而啟動(dòng)caspase依賴性凋亡發(fā)生，Bcl-2通過與Bax結(jié)合具有抗凋亡作用[14]。本研究中抑制Gm4419表達(dá)顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Bax蛋白水平，升高Bcl-2表達(dá)水平，與其抗凋亡作用一致。氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的始動(dòng)因素，其可促進(jìn)Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化以及隨后突觸和神經(jīng)元的丟失，直接參與AD發(fā)生和進(jìn)展[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，通過檢測(cè)細(xì)胞中MDA水平可有效反應(yīng)細(xì)胞氧化損傷程度[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)抑制Gm4419表達(dá)顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中MDA含量，并提高SOD活性。以上研究提示抑制Gm4419表表達(dá)可減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

大量研究表明lncRNA通過與miRNA相互作用抑制miRNA活性是其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要機(jī)制。如沉默lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)通過上調(diào)miR-15a表達(dá)可改善AD小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力，改善病理損傷，增強(qiáng)海馬神經(jīng)元抗氧化能力，抑制神經(jīng)元凋亡[17]。lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)通過靶向miR-125b顯著抑制神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥，刺激神經(jīng)突生長(zhǎng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12損傷后miR-703表達(dá)降低，進(jìn)一步研究證實(shí)miR-703是Gm4419的靶基因，且過表達(dá)或抑制Gm4419分別下調(diào)或上調(diào)miR-703表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染miR-703進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-703顯著抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，與抑制Gm4419表達(dá)的保護(hù)作用一致。進(jìn)一步恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，抑制miR-703表達(dá)顯著減弱Gm4419抑制對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，這進(jìn)一步說明Gm4419可能通過靶向負(fù)調(diào)控miR-703表達(dá)參與Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。但本研究仍限于體外研究，后續(xù)將在動(dòng)物模型中進(jìn)一步確定lncRNA Gm4419/miR-703分子軸在Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的作用。

總之，本研究證實(shí)抑制lncRNA Gm4419通過上調(diào)miR-703表達(dá)能夠減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，這為靶向lncRNA Gm4419/miR-703分子軸防治AD奠定理論基礎(chǔ)。