封雪 王詠強(qiáng) 趙濱濱

胃癌發(fā)病率和死亡率分別高居全球惡性腫瘤排行榜第四位和第二位，已成為一種全球性重大健康問題[1]。隨著胃癌綜合診斷和治療手段不斷進(jìn)展，胃癌患者預(yù)后得到改善，但由于胃癌細(xì)胞的異常存活和惡性遷移、侵襲，胃癌患者的長期生存率仍較低[2]。手術(shù)是臨床胃癌治療重要手段之一，研究顯示圍手術(shù)期麻醉藥的應(yīng)用可能影響腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的行為，與癌癥的不良結(jié)局有關(guān)[3]。七氟醚是臨床常用麻醉藥之一，具有用藥劑量小、對血液動力學(xué)影響輕微、蘇醒快等優(yōu)勢。最近研究表明，七氟醚通過調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)表達(dá)對結(jié)直腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用[4-6]。miR-4458是一種乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌抑癌基因，上調(diào)miR-4458表達(dá)對癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有顯著抑制作用[7,8]。異丙酚對肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用亦與上調(diào)miR-4458表達(dá)有關(guān)[9]。但miR-4458在胃癌中的作用、七氟醚是否調(diào)控miR-4458表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究重點探討了七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1增殖和凋亡的影響，并探討其機(jī)制是否與調(diào)控miR-4458表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 SNU-1細(xì)胞、GES細(xì)胞購于武漢普諾賽生命科技公司；七氟醚購于上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；miRNA模擬物(mimics)、抑制物(anti-miRNA)購于北京華大基因公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium)MTT試劑盒、總RNA提取試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物公司；Transwell小室購于美國密理博公司；兔源β-actin(β-肌動蛋白)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、機(jī)制金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9抗體等一抗以及羊抗兔IgG二抗購于美國CST公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA定量PCR試劑盒購于美國GeneCopoeia公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：SNU-1細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照1∶4比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，換液頻率為每周2～3次，選取第3次對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于密閉培養(yǎng)箱中，進(jìn)氣口、出氣口分別連接麻醉氣體揮發(fā)罐(5% CO2、21% O2、74% N2)、氣體分析儀。將混合氣體瓶連接麻醉機(jī)，打開混合氣體瓶預(yù)充氣3 min，隨后調(diào)整氣流為0.5 L/min。隨后打開麻醉揮發(fā)罐，維持適當(dāng)麻醉氣體濃度，37℃處理6 h，取出平板常規(guī)培養(yǎng)24 h[10]，隨后測定細(xì)胞活力、遷移和凋亡情況。

1.2.2 實驗分組：將SNU-1細(xì)胞分為正常對照(NC)組：進(jìn)充入混合氣體；1.7%給藥組：七氟醚濃度為1.7%；3.4%給藥組：七氟醚濃度為3.4%；5.1%給藥組：七氟醚濃度為5.1%。為證實miR-4458對SNU-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，利用脂質(zhì)體法將miR-NC、miR-4458 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4458瞬時轉(zhuǎn)染至SNU-1，依次記為miR-NC組、miR-4458 mimics組、anti-miR-NC組、anti-miR-4458組，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。為證實七氟醚是通過調(diào)控miR-4458表達(dá)進(jìn)而影響SNU-1細(xì)胞生物學(xué)行為，對轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-4458的SNU-1細(xì)胞(轉(zhuǎn)染48 h)進(jìn)行七氟醚處理6 h，依次記為5.1%給藥+anti-miR-NC組、5.1%給藥+anti-miR-4458組，常規(guī)培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)分析。人正常胃黏膜細(xì)胞(GES1)組：正常培養(yǎng)的GES1細(xì)胞；GES1(5.1%給藥組)：七氟醚濃度為5.1%。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力:將各組SNU-1細(xì)胞接種到96孔板上，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液在37℃下孵育4 h。之后，棄去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入150 μl的二甲基亞砜以溶解晶體。酶標(biāo)儀測量570 nm波長的吸光度(A)來確定細(xì)胞活力。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:Annexin V結(jié)合緩沖液重懸各組細(xì)胞，向100 μl細(xì)胞懸液中加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI暗室孵育15 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移:將各組細(xì)胞重懸在不含胎牛血清的培養(yǎng)液中，分別200 μl加入Transwell上室中，而下室中加入500 μl含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃下孵育12 h后，用無菌棉擦去上室內(nèi)未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定Transwell膜下表面遷移細(xì)胞10 min，室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡下隨機(jī)選擇3個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以平均值表示細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá):放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液裂解各組細(xì)胞，BCA分析試劑盒測量蛋白濃度。100℃變性5 min，隨后取等量變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上后，將膜與5%脫脂牛奶室溫下孵育1 h，再將膜與特異性一抗(均1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。然后將膜與相應(yīng)二抗室溫下孵育2 h。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，目的蛋白和內(nèi)參β-actin灰度值比值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-4458表達(dá):總RNA提取試劑盒分別提取各組細(xì)胞總RNA，用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再采用miRNA qPCR試劑盒進(jìn)行定量分析。2-ΔΔCt方法計算miR-4458表達(dá)量。miR-4458上游引物5’-AGAGGTAGGTGTGG

AAGAA-3’，下游引物5’-GCGAGCACAGAATTAATAC

GA C-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低，而凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。七氟醚(5.1%)處理后GES1細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、凋亡率無顯著變化。見圖1，表1。

圖1 不同濃度七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1細(xì)胞凋亡的影響

表1 不同濃度七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響

2.2 不同濃度七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

表2 七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

2.3 不同濃度七氟醚對miR-4458表達(dá)的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細(xì)胞中miR-4458表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4 miR-4458對胃癌細(xì)胞SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響 與miR-NC組比較，miR-4458組SNU-1細(xì)胞miR-4458表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白

表3 七氟醚對miR-4458表達(dá)的影響

表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與anti-miR-4458組比較，anti-miR-4458組SNU-1細(xì)胞miR-4458表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 miR-4458對胃癌細(xì)胞SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響

圖3 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

2.5 抑制miR-4458表達(dá)逆轉(zhuǎn)七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響 與5.1%給藥+anti-miR-NC組比較，5.1%給藥+anti-miR-4458組SNU-1細(xì)胞miR-4458表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

表5 anti-miR-4458逆轉(zhuǎn)七氟醚對胃癌細(xì)胞SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響

3 討論

癌細(xì)胞的異常遷移和侵襲在胃癌復(fù)發(fā)中具有重要作用。已有研究顯示麻醉藥的使用可影響癌癥患者的臨床結(jié)局。七氟醚是臨床常用吸入性麻醉劑，已被證實在肺癌、乳腺癌等多種實體腫瘤中具有抗增殖、抗轉(zhuǎn)移和促凋亡作用[11]。Yang等[12]研究顯示七氟醚可能通過抑制ERK信號通路參與結(jié)腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控抑癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。Kang等[13]報道七氟醚調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路以劑量依賴的方式抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與上述研究類似，本研究中七氟醚處理后SNU-1細(xì)胞活力、侵襲數(shù)量顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著增加，并呈劑量依賴效應(yīng)。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控重要參與者，其通過促進(jìn)周期向S期推進(jìn)具有抗增殖作用，研究指出川芎嗪通過下調(diào)CyclinD1表達(dá)誘導(dǎo)G1期阻滯具有顯著的抗腫瘤作用[14]。MMP-2和MMP-9能夠消化細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜從而提高腫瘤細(xì)胞的運動能力進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，降低MMP-2和MMP-9表達(dá)量可有效胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[15]。本研究中七氟醚以劑量依賴方式降低CyclinD1、MMP-2以及MMP-9表達(dá)水平，與其抗增殖、抗遷移作用相吻合。此外，本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚處理還可降低凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)水平。以上研究表明，七氟醚通過調(diào)控增殖、遷移和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞SNU-1增殖、遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miRNA通過與靶mRNA結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)過程參與癌癥發(fā)生發(fā)展。研究表明miR-4458表達(dá)降低與肝癌患者預(yù)后差呈正相關(guān)[16]。血管瘤中過表達(dá)miR-4458顯著抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，而抑制miR-4458表達(dá)可逆轉(zhuǎn)G0/G1期阻滯和細(xì)胞凋亡[17]。此外，敲減Circ_0000337顯著促進(jìn)miR-4458表達(dá)降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力從而抑制骨肉瘤進(jìn)展[18]。本研究中轉(zhuǎn)染miR-4458 mimics發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-4458顯著降低SNU-1細(xì)胞活力和遷移能力，下調(diào)CyclinD1、MMP-2以及MMP-9表達(dá)，上調(diào)Cleaved-caspase-3，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而轉(zhuǎn)染anti-miR-4458抑制miR-4458表達(dá)則促進(jìn)SNU-1細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，這提示miR-4458在胃癌中具有抑癌作用。

近年來多項研究指出七氟醚通過調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)對癌細(xì)胞發(fā)揮作用[17-20]。如七氟醚通過上調(diào)miR-124-3p表達(dá)抑制Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶(ROCK1)信號通路進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[19]。結(jié)腸癌中七氟醚通過調(diào)節(jié)miR-203表達(dá)抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)/MMP-9通路抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲[20]。本研究中七氟醚處理后SNU-1細(xì)胞中miR-4458表達(dá)呈以劑量依賴方式增加，提示七氟醚在胃癌中抗腫瘤作用與誘導(dǎo)miR-4458表達(dá)增加有關(guān)。深入研究顯示，抑制miR-4458表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)七氟醚對SNU-1細(xì)胞增殖、遷移、凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，恢復(fù)SNU-1細(xì)胞增殖、遷移能力以及凋亡水平。以上研究提示七氟醚通過上調(diào)SNU-1細(xì)胞中miR-4458水平發(fā)揮其抗增殖、抗侵襲和促凋亡作用。

綜上所述，本研究證實七氟醚通可抑制胃癌SNU-1細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與過上調(diào)miR-4458表達(dá)有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)有助于全面了解七氟醚的藥理作用，為胃癌患者選擇更合理的麻醉藥提供實驗依據(jù)。