曹舒興 周楠 王進(jìn) 趙立輝 曹光 馬維 李明

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種伴有疼痛的致殘性進(jìn)行性退行性疾病。據(jù)統(tǒng)計，髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的OA殘疾患者從1990年的1 050萬增加到2010年的1 710萬[1]。其主要病變?yōu)檐浌峭俗?，包括軟骨?xì)胞的死亡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。目前雖然提出了很多方式預(yù)防延緩OA的發(fā)生，但還未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法來逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展[1]，此外，目前大部分OA藥物在長期使用過程中出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，探索新型安全性治療方法對OA患者來講是必要的。細(xì)胞自噬作為一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,它通過清除細(xì)胞內(nèi)未折疊的蛋白和受損的細(xì)胞器，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，近年來逐漸成為新的治療靶點[2,3]。mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,the mammalian target of Rapamycin，mTOR)屬于PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶,phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)蛋白激酶類家族中成員，是許多與自噬相關(guān)的信號通路交匯節(jié)點，而且與骨關(guān)節(jié)炎有著密切的聯(lián)系[4-6]，其中Akt-mTOR信號通路對自噬起重要的負(fù)調(diào)控作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物根莖中提取的一種天然酚性色素，其抗炎抗氧化的特性使姜黃素在改善OA的中藥領(lǐng)域中脫穎而出[7,8]。據(jù)報道，姜黃素可以調(diào)控一系列信號通路的抑制和激活，包括核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈(nuclear factor-k-gene binding,NF-kB)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of tran-ions,STAT)通路等等[9]。但目前關(guān)于姜黃素對骨關(guān)節(jié)疾病的作用和機(jī)制研究較少。因此，本研究以大鼠OA模型為研究對象，以 PI3K-Akt-mTOR信號通路為切入點,探討姜黃素通過調(diào)控細(xì)胞自噬減輕大鼠OA的作用及可能機(jī)制，為OA的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級SD雄性大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2018-1-003，雄性，200～240 g，在恒溫恒濕、明暗交替的環(huán)境中喂養(yǎng)，均可自由獲得水和食物，飼養(yǎng)1周后用于實驗。所有動物實驗按照本院動物保護(hù)機(jī)構(gòu)和倫理委員會的批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器 姜黃素、尼古丁均購自Sigma公司；TUNEL試劑盒購自Abcam公司；抗體 β-actin、procaspase-3、caspase-3及其活化狀態(tài)(Active p19、Active p17)、Bax、Bcl-2、LC3、Beclin 1、p62、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt及其下游激酶P70小體S6激酶(p70 ribosomal S6 kinase，P70S6K)等抗體均購自 CST 公司。DMEM 培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、BlueRanger預(yù)染蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自美國Thermo公司。組織切片機(jī)(德國徠佧);酶標(biāo)儀(Tecan，Mannedorf，Switzerland)，電泳及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)，Odyssey掃 描儀(LiCor公司,美國),普通倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(Olympus公司,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及給藥：30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，手術(shù)組和治療組，每組10只。采用改良Hulth法制備大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，即取髕骨旁內(nèi)側(cè)切口顯露膝關(guān)節(jié)，切斷前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，切除2/3半月板，保留關(guān)節(jié)面。假手術(shù)組只暴露膝關(guān)節(jié)前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，而不作任何其他處理。假手術(shù)組、手術(shù)組給予PBS灌胃，治療組在術(shù)后即灌胃給藥(姜黃素50 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥8周[9]。

1.3.2 軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：將假手術(shù)組、手術(shù)組、治療組大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨組織切成<1 mm的碎片，用0.25 g/L胰蛋白酶消化，然后用2 g/L的膠原酶Ⅱ孵育8 h，未消化的組織用180 μm細(xì)胞過濾器過濾，1 500 r/min離心10 min，錐蟲藍(lán)染色，檢測細(xì)胞活力。在添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(100 U/ml青霉素和0.1 g/L鏈霉素)的DMEM中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO培養(yǎng)箱中。在通路Akt-mTOR檢測部分，提取進(jìn)行改良Hulth法手術(shù)后的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞原代培養(yǎng)，分為4組：分別為手術(shù)組(原代細(xì)胞不額外添加其他試劑)、姜黃素組(添加40 μmol/L姜黃素處理24 h)、尼古丁組(添加2.5 μmol/L尼古丁處理24 h，該濃度可以顯著激活mTOR通路且不影響細(xì)胞狀態(tài))、姜黃素+尼古丁組(姜黃素處理前2 h給予尼古丁(2.5 μmol/L)進(jìn)行處理)，以上各組處理24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行測試。

1.3.3 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dTUP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)染色：在姜黃素處理8周后，處死動物進(jìn)行原位凋亡檢測，膝關(guān)節(jié)樣品用福爾馬林固定，脫鈣，石蠟包埋，切片經(jīng)二甲苯脫蠟和分級濃度的醇脫水后，用原位凋亡檢測試劑盒TUNEL染色進(jìn)行軟骨細(xì)胞凋亡分析，光鏡下檢測陽性信號。采用TUNEL染色(綠色)和DAPI核復(fù)染(藍(lán)色)來評估軟骨細(xì)胞凋亡。凋亡率(%)定義為每個切片同一平面內(nèi)陽性細(xì)胞核總數(shù)與現(xiàn)存細(xì)胞總數(shù)之比。比較各組細(xì)胞凋亡率，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.4 組織檢查和免疫組化：番紅-O固綠染色可評估軟骨退化情況，原理在于嗜堿性的軟骨與堿性染料番紅O結(jié)合呈現(xiàn)紅色。切片固定后用番紅-O染色，鏡檢。軟骨和軟骨下板厚度的蛋白多糖缺失根據(jù)Mankin評分方法進(jìn)行評估。切片常規(guī)脫蠟后進(jìn)行LC-3的免疫組織化學(xué)染色。

1.3.5 Western blot檢測：使用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液從大鼠軟骨組織/軟骨原代細(xì)胞中提取胞漿蛋白，等量的蛋白質(zhì)(30 μg)在SDS-PAGE凝膠上分離并電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，用一抗孵育膜過夜，第2天PBST洗3次后，二抗室溫孵育1 h，PBST洗3次，暗房曝光。采用Image J對條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素可降低OA的嚴(yán)重程度 通過番紅-O染色和Mankin’s評分評估關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)特征來確定姜黃素對OA大鼠的影響。術(shù)后8周，大鼠出現(xiàn)OA病理學(xué)特征，表現(xiàn)為番紅-O染色紅色減少，細(xì)胞密度下降。治療組軟骨細(xì)胞密度增加，表明姜黃素可減輕大鼠OA嚴(yán)重程度。定量分析手術(shù)組軟骨厚度明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，以及姜黃素處理后治療組延緩了組織降解(P<0.05)。此外，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組的Mankin’s評分顯著升高(P<0.05)，姜黃素治療組的Mankin’s評分顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 術(shù)后8周假手術(shù)組、手術(shù)組、治療組關(guān)節(jié)軟骨番紅-O染色

表1 3組相對軟骨厚度及Mankin’s評分

2.2 姜黃素抑制大鼠OA軟骨細(xì)胞凋亡 為了進(jìn)一步研究姜黃素對OA中軟骨細(xì)胞凋亡的影響，我們對關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行TUNEL染色分析，采用TUNEL染色和DAPI核復(fù)染來評估軟骨細(xì)胞凋亡。與假手術(shù)組相比，術(shù)后8周OA大鼠出現(xiàn)軟骨退化，軟骨細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)。姜黃素治療后，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量減少，大鼠軟骨損傷改善，細(xì)胞凋亡減少。Western blot檢測凋亡相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)一步證實了姜黃素對OA細(xì)胞凋亡活性的影響：caspase-3的激活以及Bax/Bcl2比值在姜黃素治療后明顯被抑制(P<0.05)。見表2，圖2、3。

表2 3組細(xì)胞凋亡標(biāo)記物相對蛋白量

圖2 3組OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中caspase-3和Bax/Bcl-2的相對蛋白表達(dá)

圖3 姜黃素抑制OA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡TUNEL染色分析(×40)

2.3 姜黃素增強(qiáng)OA大鼠軟骨細(xì)胞自噬 自噬是正常軟骨的另一種保護(hù)機(jī)制。為了探討姜黃素對自噬的影響，我們對OA大鼠關(guān)節(jié)組織LC-3的表達(dá)進(jìn)行了免疫組化分析，姜黃素治療組大鼠LC-3的表達(dá)明顯高于手術(shù)組。Western blot檢測了自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin1的表達(dá)水平，進(jìn)一步證實了這一觀察結(jié)果：與未治療大鼠相比，姜黃素治療后LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin1的表達(dá)均顯著升高，而p62的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4、5，表3。

2.4 姜黃素通過AKT/mTOR通路調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬

圖4 姜黃素可有效促進(jìn)OA大鼠軟骨細(xì)胞自噬(免疫組×40)

圖5 姜黃素抑制OA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)

表3 3組軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物相對蛋白量比較

Western blot結(jié)果顯示，mTOR、Akt、及其下游激酶p-P70s6k在OA大鼠中的表達(dá)水平較高，而姜黃素處理后mTOR、Akt、p-P70s6k的表達(dá)水平較未處理大鼠顯著降低(P<0.05)。Akt和mTOR的磷酸化位點分別為Ser473和Ser2448，提示AKT/mTOR通路可能參與姜黃素對OA大鼠軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)控過程。為了進(jìn)一步確定姜黃素對軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)控是否依賴于Akt/mTOR，我們提取了進(jìn)行改良Hulth法手術(shù)后的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞原代培養(yǎng)，分別添加40 μmol/L姜黃素、2.5 μmol/LAkt/mTOR通路激活劑尼古丁、姜黃素聯(lián)合尼古丁[姜黃素處理前2 h給予尼古丁(2.5 μmol/L)進(jìn)行處理]，以上各組處理24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行測試。當(dāng)給予姜黃素+尼古丁處理后，相比于單純給予姜黃素，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平明顯下降(P<0.01)。結(jié)果證實了姜黃素對軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)控作用依賴于Akt/mTOR信號通路。見表4、5，圖6、7。

表4 3組Akt/mTOR通路相對蛋白量比較

表5 尼古丁預(yù)處理后4組Akt/mTOR通路相對蛋白量比較

圖6 3組關(guān)節(jié)軟骨組織中p-mTOR, p-Akt, p-P70S6K蛋白表達(dá)水平

圖7 尼古丁激活后各組p-mTOR, p-Akt, p-P70S6K蛋白表達(dá)水平

3 討論

OA是一種進(jìn)展緩慢的疾病，伴有明顯的關(guān)節(jié)軟骨喪失和纖維化。年齡增長是OA發(fā)病和進(jìn)展的主要危險因素[10]。然而，由于關(guān)節(jié)不穩(wěn)定和生物力學(xué)改變而導(dǎo)致的韌帶斷裂在10～15年后導(dǎo)致人類發(fā)生OA[11,12]。因此，手術(shù)不穩(wěn)定模型已成為實驗動物中最常見、最流行的OA模型[13]。與自發(fā)性模型相比，外科手術(shù)模型發(fā)病速度更快，變異更少，以及對遺傳背景的依賴更小[14]。

在本研究中，我們采用Hulth法誘導(dǎo)大鼠OA模型，結(jié)果表明，姜黃素能有效改善OA模型大鼠的關(guān)節(jié)軟骨損傷，并且這種改善是通過促進(jìn)自噬實現(xiàn)的。姜黃素誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)與OA模型大鼠Akt/mTOR信號通路有關(guān)。

大量的臨床實驗已經(jīng)證實姜黃素對OA具有治療作用[15]。姜黃素保護(hù)軟骨的機(jī)制之一是其抗軟骨細(xì)胞凋亡的作用。一項研究通過免疫印跡和電鏡[3]檢測表明姜黃素可抑制IL-1β刺激的人軟骨細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們觀察到OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨體中凋亡的軟骨細(xì)胞顯著增加。

動物和人類膝關(guān)節(jié)軟骨的衰老與自噬減少有關(guān)，主要表現(xiàn)為自噬關(guān)鍵調(diào)控因子包括ULK1、Beclin 1和LC3[16]的表達(dá)降低。Beclin1通過使自噬相關(guān)蛋白聚集并啟動自噬；LC3可以調(diào)控自噬泡的形成，其中LC3-Ⅰ型能夠通過泛素化修飾轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ型，后者數(shù)量與自噬體數(shù)量成正比；而p62能夠和待降解物結(jié)合，隨著自噬作用的增加而不斷地被消耗[16,17]。與衰老相關(guān)的OA一樣，手術(shù)誘導(dǎo)的OA小鼠也表現(xiàn)出自噬減少和相關(guān)的凋亡增加[17]。通過對健康人和OA患者關(guān)節(jié)軟骨自噬基因表達(dá)分析顯示，在OA組織中LC3、Beclin1等20個下調(diào)的自噬相關(guān)基因，這些變化與細(xì)胞死亡/凋亡的重要調(diào)控因子上調(diào)[18]有關(guān)。已有文獻(xiàn)表明，蔗糖[19]、雷帕霉素[20]等生物活性成分對OA的治療作用與通過調(diào)控Akt/mTOR信號通路增加自噬有關(guān)。Akt屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)控mTOR最重要的直接上游分子，細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白的磷酸化后即被激活、進(jìn)而活化下游mTOR(最關(guān)鍵的自噬負(fù)調(diào)控因子)，細(xì)胞自噬抑制水平可以在很大程度上從Akt-mTOR通路的激活程度反映[17-19]。本研究中，我們的實驗結(jié)果表明，在OA模型中LC3和Beclin1下調(diào)，Akt/mTOR通路激活，自噬減少；姜黃素治療后，LC3和Beclin1上調(diào)，Akt/mTOR通路抑制，自噬增加，且我們在姜黃素聯(lián)合尼古丁處理的軟骨原代細(xì)胞中驗證了姜黃素調(diào)節(jié)軟骨自噬作用依賴于Akt/mTOR通路。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，姜黃素通過Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬，在OA大鼠中發(fā)揮了治療作用。在此次研究中尚有不足：第一，不同濃度的姜黃素對大鼠軟骨組織修復(fù)有何影響路還未闡明，在今后的研究中將通過不同濃度、不同治療時間的姜黃素處理以明確此問題；第二，仍需要進(jìn)一步細(xì)胞實驗支持此次研究的發(fā)現(xiàn)，更加明確姜黃素對細(xì)胞自噬的潛在作用。