高 陽(yáng)，盧福榮

1.歐陸食品檢測(cè)服務(wù)(大連)有限公司，遼寧 大連 116023；2.營(yíng)口市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 營(yíng)口 115000

霉菌和酵母菌是食品正常菌相的一部分，有些可用來(lái)加工食品，也可能導(dǎo)致食品腐敗，影響食品質(zhì)量。因此評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌也包括霉菌和酵母，其計(jì)數(shù)結(jié)果可用來(lái)評(píng)判食品被污染的程度。目前國(guó)內(nèi)外均規(guī)定了各種對(duì)霉菌和酵母菌的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，其中平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果相對(duì)精準(zhǔn)[1]，故本試驗(yàn)采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(ISO 21527—2008)中平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)霉菌和酵母菌，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果的精密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

精密度分析可用于定量方法方法確認(rèn)，也可用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量監(jiān)控。一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過(guò)一個(gè)方法確認(rèn)時(shí)所獲得的質(zhì)量指標(biāo)包括重復(fù)性限(r)、重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sr)、重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDr)、再現(xiàn)性限(R)、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(SR)、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDR)[2]。本次試驗(yàn)采用GB/T 6379.2—2004規(guī)定的重復(fù)性計(jì)算方法和《食品微生物檢測(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)》中的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)期間再現(xiàn)性(本試驗(yàn)采用不同分析人)推導(dǎo)方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性統(tǒng)計(jì)分析，該實(shí)驗(yàn)室內(nèi)期間再現(xiàn)性推導(dǎo)方法是由ISO TS 19036:2006/Amd 1:2009中提出的方法改進(jìn)而來(lái)的。因此本試驗(yàn)所獲得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差用于評(píng)定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)該方法確認(rèn)結(jié)果，同時(shí)其重復(fù)性限和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性限指標(biāo)亦可為日后該檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種來(lái)源

白曲霉CICC 41312，由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。釀酒酵母ATCC 9763，由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.1.2培養(yǎng)基

DG18瓊脂培養(yǎng)基；0.1%蛋白胨水(PW)。

1.1.3試劑與儀器

霉菌培養(yǎng)箱：(25±1)℃；恒溫水浴鍋：(46±1)℃；電子天平：分度值0.1 g；均質(zhì)器；移液器；無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

1.2 方法

1.2.1檢測(cè)樣品制備

本實(shí)驗(yàn)選擇的樣品基質(zhì)為有機(jī)食葵仁(水活度<0.95)，其自然污染水平小于10 CFU/g，使用人工污染樣品方式，添加陽(yáng)性菌種白曲霉和釀酒酵母。白曲霉陽(yáng)性添加量為104～105CFU/25 g；釀酒酵母陽(yáng)性添加量為105～106CFU/25 g。

因微生物檢測(cè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中要求重復(fù)性的測(cè)定通常需要測(cè)定10個(gè)以上的測(cè)試樣品[3]，故本試驗(yàn)采用11個(gè)測(cè)試樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性試驗(yàn)。

1.2.2霉菌酵母菌檢測(cè)方法

按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 21527-2:2008 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 2:Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95 規(guī)定的傾注平板法檢測(cè)程序進(jìn)行。

檢測(cè)過(guò)程為：

① 無(wú)菌稱(chēng)取25 g樣品并加入225 mL PW，置于無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)，用拍打式均質(zhì)器拍打1 min，充分混合制成10-1初始稀釋液。

② 取兩塊無(wú)菌平皿。用2 mL無(wú)菌吸管分別吸取 1 mL 樣品的初始懸浮液(10-1稀釋度)加到每塊平皿中。

③ 用2 mL無(wú)菌吸管轉(zhuǎn)移1.0 mL 10-1稀釋溶液到9.0 mL無(wú)菌PW中，充分混合制得10-2稀釋溶液。

④ 另取兩塊無(wú)菌平皿，用另一支無(wú)菌吸管，分別吸取 1 mL 10-2樣品稀釋液加到每塊平皿中。

⑤ 另取一支新的2 mL無(wú)菌吸管，重復(fù)上述③操作，獲得進(jìn)一步稀釋?zhuān)驹囼?yàn)一直稀到10-5稀釋度。每稀釋一次即換用1支新的滅菌吸管。

⑥ 試驗(yàn)選取后4個(gè)連續(xù)的十倍稀釋液接種到平皿中，以期獲得生長(zhǎng)菌落數(shù)小于150 CFU的平皿，以便計(jì)數(shù)。

⑦ 每塊平皿倒入20 mL～25 mL冷卻到 44 ℃～47 ℃的DG18瓊脂，從制備好初始懸浮液(如果是液體樣品為10-1稀釋液)向平皿內(nèi)傾倒瓊脂，時(shí)間不得超過(guò) 45 min。

⑧ 采用順時(shí)針逆時(shí)針各三圈、水平和左右方向各三次的方式，將接種液體與瓊脂混合均勻，平皿放置在涼的水平面上待凝固[4]。

⑨ 將平皿正置于(25±1)℃的霉菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 5 d。

⑩ 菌落計(jì)數(shù)。選擇菌落數(shù)少于150 CFU的培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)，必要時(shí)使用雙目放大鏡或顯微鏡進(jìn)行檢查，以便區(qū)分酵母或霉菌和菌落中的細(xì)菌。

1.2.3重復(fù)性測(cè)量方案

1.2.3.1 重復(fù)性檢測(cè)

由操作人員A或操作人員B對(duì)11份人工污染有機(jī)食葵仁樣品進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)，試驗(yàn)方案的描述如圖1，即對(duì)1個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一個(gè)操作人員對(duì)11個(gè)樣品的1個(gè)污染水平取兩次試驗(yàn)的用量，制備初級(jí)稀釋液進(jìn)行重復(fù)2次檢測(cè)，共22次測(cè)試。具體檢測(cè)方法按1.2.2 霉菌酵母菌檢測(cè)方法進(jìn)行。

圖1 測(cè)算試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性的試驗(yàn)方案

1.2.3.2 重復(fù)性計(jì)算[5,6]

(1-1)

(1-2)

(1-3)

1.2.4再現(xiàn)性測(cè)量方案

1.2.4.1 再現(xiàn)性檢測(cè)

由操作人員A和操作人員B分別對(duì)11份人工污染有機(jī)食葵仁樣品進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)，試驗(yàn)方案的描述如圖2，即對(duì)1個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)每個(gè)操作人員對(duì)11個(gè)樣品的1個(gè)污染水平取兩次試驗(yàn)的用量，制備初級(jí)稀釋液進(jìn)行重復(fù)2次檢測(cè)，共44次測(cè)試。具體檢測(cè)方法按1.2.2 霉菌酵母菌檢測(cè)方法進(jìn)行。

圖2 測(cè)算試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性的試驗(yàn)方案

1.2.4.2 再現(xiàn)性計(jì)算[6-8]

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性方差：

(2-1)

再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為獨(dú)立數(shù)據(jù)集平均方差的平方根，將方差之和除以n，即：

(2-2)

(2-3)

(2-4)

(2-5)

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

對(duì)兩名操作人員A、B在同一天檢測(cè)的11個(gè)人工污染有機(jī)食葵仁樣品的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行歸納分析，詳細(xì)計(jì)算數(shù)據(jù)分別見(jiàn)表1和表2。

表1 11組霉菌計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)對(duì)的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性計(jì)算

表2 11組酵母菌計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)對(duì)的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性計(jì)算

2.1.1重復(fù)性(Sr)

2.1.2重復(fù)性限(r)

2.1.3再現(xiàn)性(SiR)

2.1.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性限(iR)

2.2 討論

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性是定量分析試驗(yàn)的精密度指標(biāo)，指在相同的條件下(如：設(shè)備、操作者、實(shí)驗(yàn)室或培養(yǎng)時(shí)間)對(duì)同一個(gè)樣品使用相同的方法分析獲得的一系列獨(dú)立測(cè)試結(jié)果之間的一致程度。再現(xiàn)性分為實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中指出實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性是指再現(xiàn)性條件下單個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)再現(xiàn)性的測(cè)量[9]。因此在試驗(yàn)中得出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差能夠反映不同平均值的變異程度。結(jié)合霉菌和酵母菌的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果，以表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室該方法確認(rèn)結(jié)果。本試驗(yàn)人工污染有機(jī)食葵仁的霉菌重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.07%和2.70%，內(nèi)部再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.25%；酵母菌重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.00%和1.13%，內(nèi)部再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.47%，結(jié)果均小于5%，表明本次試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著性差異。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)霉菌精密度檢測(cè)結(jié)果：分析人A重復(fù)性SrA為0.135，重復(fù)性限r(nóng)為0.374；分析人B霉菌重復(fù)性SrB為0.118，重復(fù)性限r(nóng)為0.328。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性SR=±0.099，再現(xiàn)性限R為0.274。

本實(shí)驗(yàn)酵母菌精密度檢測(cè)結(jié)果：分析人A重復(fù)性SrA為0.105，重復(fù)性限r(nóng)為0.291；分析人B重復(fù)性SrB為0.060，重復(fù)性限r(nóng)為0.167。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性SiR=±0.078，再現(xiàn)性限R為0.215。