劉鐵平，孫 勇，薛仲華，曹紅森

1.上海禾向健康科技發(fā)展有限公司，上海 201199；2.華東理工大學(xué)，上海 200237；3.上海漫虹生物科技有限公司，上海 202154

隨著人民物質(zhì)生活水平的提高，純天然、多功能、無刺激、無副作用的化妝品越來越受人們的喜愛，具有保濕抗皺美白活性的天然產(chǎn)物在護(hù)膚品中應(yīng)用已成為化妝品行業(yè)未來發(fā)展方向。靈芝中含有豐富的靈芝單、多糖、氨基酸、多肽、三萜類等天然化合物成分，它們具有良好的吸濕保濕功效。具有保濕抗皺美白活性的天然產(chǎn)物在護(hù)膚品中應(yīng)用已成為化妝品行業(yè)未來發(fā)展方向[1-2]。

研究表明靈芝具有抗氧化、延緩衰老、抗皺、美白等護(hù)膚作用，目前市場上絕大部分靈芝類護(hù)膚品是利用靈芝子實體提取液進(jìn)行加工的，其活性成分含量低、有效成分少，有重金屬殘留和農(nóng)藥殘留等缺點。靈芝深層培養(yǎng)液是利用靈芝菌種進(jìn)行深層培養(yǎng)而得，具有小分子功效成分豐富、活性高、含量高、易吸收、純天然、質(zhì)量穩(wěn)定可控等優(yōu)點[3-4]。

由此可見，靈芝深層培養(yǎng)液將成為靈芝類保濕抗皺美白活性護(hù)膚品發(fā)展的未來方向。劉博等對靈芝深層培養(yǎng)液成分及復(fù)配的靈芝類護(hù)膚品在保濕抗皺增效功效方面做了初步實驗探究[5]。

1 實驗儀器與試劑

1.1 實驗儀器

皮膚水份測試儀Corneometer CM825，德國CK公司。皮膚彈性測試 Cutometer dual MPA580，德國CK公司。皮膚快速光學(xué)成像系統(tǒng) PRIMOS lite，德國CK 司。VISIA-CR(CANFIELD,美國)。

1.2 實驗試劑與材料

靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定并保藏于杭州雪域生物技術(shù)有限公司(No.2014394)，為深層培養(yǎng)菌種。

2 實驗方法

2.1 靈芝深層培養(yǎng)液的制備[6-8]

2.1.1用杭州雪域生物技術(shù)有限公司保藏靈芝菌種(No.2014394)為深層培養(yǎng)菌種，培養(yǎng)基為玉米淀粉1.5%、大豆蛋白1%、酵母膏0.5%、葡萄糖1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%等，與一定量水加入生物反應(yīng)器內(nèi)，蒸汽滅菌后冷卻接種培養(yǎng)。

2.1.2接種靈芝菌種后進(jìn)行生物反應(yīng)器內(nèi)液體深層培養(yǎng)，培養(yǎng)參數(shù)為：罐壓0.1 Mp、溫度(26±1)℃、攪拌速度120 r/min～150 r/min、培養(yǎng)時間46 h～50 h。培養(yǎng)后液經(jīng)離心分離所得濾液即為靈芝深層培養(yǎng)液。

2.2 靈芝護(hù)膚品性能及對照組比較[9-11]

以靈芝深層培養(yǎng)液代替?zhèn)鹘y(tǒng)護(hù)膚品配方中保濕劑組分制成靈芝保濕抗皺套裝，對照組為傳統(tǒng)配方。

2.3 受試人群的選定

選擇臉部為干性肌膚，臉部皮膚角質(zhì)層水分含量值小于65，眼部皮膚有皺紋，眼角皺紋評分大于等于3分(D0)受試者66名，年齡范圍在45～60周歲。受試者在臉部使用測試產(chǎn)品前、連用14 d后及連用28 d后分別進(jìn)行皮膚角質(zhì)層含水量、皮膚彈性、眼角圖像拍攝、臉部成像采集、自我評估問卷、并由1名專家評價員對受試者的眼角皺紋進(jìn)行視感評估。產(chǎn)品使用前后的評價結(jié)果通過統(tǒng)計學(xué)檢驗方法進(jìn)行比較從而判斷是否有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 檢測部位

(1)皮膚角質(zhì)層含水量：臉頰部位；

(2)皮膚彈性：外眼角兩側(cè)；

(3)眼角圖像拍攝：外眼角兩側(cè)；

(4)臉部成像采集：整臉；

(5)自我評估問卷：整臉；

(6)專家評估-眼角皺紋：外眼角兩側(cè)。

2.5 檢測環(huán)境

本次測試的測試環(huán)境為溫度 21.3 ℃～21.8 ℃，相對濕度 46.0%～55.0%，符合方案設(shè)計的要求。

2.6 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析軟件為SPSS。在不同時間點的測量值與基礎(chǔ)值比較，使用前后比較，如果值為正態(tài)分布，則采用t檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析；如果非正態(tài)分布，可采用秩和檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析；

統(tǒng)計方法均采用雙尾檢驗，檢驗水準(zhǔn)=0.05。

安全性評價采用統(tǒng)計描述的方法，分析不良事件程度和不良事件持續(xù)時間。

計算使用前的變化率，公式如下：

使用產(chǎn)品第2周后的Δ(差值)=T2-T0

使用產(chǎn)品第4周后的Δ(差值)=T4-T0

使用產(chǎn)品第2周后：

使用產(chǎn)品第4周后：

式中，T0：使用試樣前受試區(qū)的皮膚參數(shù)本底值。

T2：受試區(qū)使用試樣第 2 周后，皮膚參數(shù)數(shù)值。

T4：受試區(qū)使用試樣第 4 周后，皮膚參數(shù)數(shù)值。

N：受試者人數(shù)。

3 測試依據(jù)

3.1 樣本完成情況

入組 66 名受試者，最終完成 66 名受試者，平均年齡為(48.95+0.07)歲。具體納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)見《附件 3：樣本完成情況》。

3.2 產(chǎn)品使用及耐受性反饋情況

每名受試者在 4 周內(nèi)按要求使用測試樣品，依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范 2015》[12]，根據(jù)不良反應(yīng)記錄結(jié)果顯示無任何不良反應(yīng)出現(xiàn)。

4 儀器檢測結(jié)果及統(tǒng)計分析

4.1 皮膚角質(zhì)層含水量(Corneometer)：

皮膚含水量(角質(zhì)層)檢測結(jié)果見表1。

表1 皮膚含水量(角質(zhì)層)檢測

結(jié)果解釋：

測試樣品連續(xù)使用第14 d、第28 d后，臉部皮膚(角質(zhì)層)含水量均有極顯著性上升(p<0.001)。

連續(xù)使用對照區(qū)組產(chǎn)品后，臉部皮膚(角質(zhì)層)含水量在第 14 d、第 28 d均無顯著性差異(p>0.05)；

測量值：皮膚角質(zhì)層含水量越高，說明皮膚角質(zhì)層水分含量越高。

(n.s.”表示無統(tǒng)計學(xué)差異，*代表0.01

4.2 皮膚角質(zhì)層水分含量(Corneometer)測試產(chǎn)品與對照區(qū)域?qū)Ρ惹闆r

皮膚含水量(角質(zhì)層)檢測結(jié)果見表2。

表2 皮膚含水量(角質(zhì)層)檢測結(jié)果

(n.s.”表示無統(tǒng)計學(xué)差異，*代表0.01

結(jié)果解釋：

連續(xù)使用樣品的區(qū)域使用的第14 d、第28 d后，使用靈芝保濕套裝的臉部皮膚(角質(zhì)層)含水量均極顯著性高于對照組(p<0.001)。

測量值：皮膚(角質(zhì)層)含水量值越高，角質(zhì)層水分含量就越高。

4.3 皮膚彈性值(Cutometer R2)

皮膚彈性值檢測結(jié)果見表3。

表3 皮膚彈性值檢測結(jié)果

連續(xù)使用測試樣品后的第14 d(見圖3)，臉部皮膚彈性值在無顯著性差異(p>0.05)，在產(chǎn)品使用的第 28 d有非常顯著性上升(0.001

(n.s.表示無統(tǒng)計學(xué)差異，*代表0.01

連續(xù)使用對照組產(chǎn)品后，臉部皮膚彈性值在使用第14 d、第28 d均無顯著性差異(p>0.05)。

測量值：產(chǎn)品試樣的皮膚彈性值越接近 1,皮膚彈性就越好。

4.4 皮膚彈性值(Cutometer)測試產(chǎn)品與對照區(qū)域?qū)Ρ惹闆r

皮膚彈性值檢測結(jié)果見表4。

表4 皮膚彈性值檢測結(jié)果

連續(xù)使用測試樣品區(qū)域的第14 d和28 d(見圖4)，測試樣品對臉部皮膚彈性值與對照組對比無顯著性差異(p>0.05)。

(n.s.表示無統(tǒng)計學(xué)差異，*代表0.01

4.5 測試樣品對眼角皺紋(Sa)影響

眼角皺紋檢測結(jié)果見表5。

表5 眼角皺紋(Sa)檢測結(jié)果

連續(xù)使用測試產(chǎn)品靈芝保濕套裝后(見圖5)，眼角皺紋在產(chǎn)品使用的第14 d、第28 d均有下降，但均無顯著性差異(p>0.05)。

(n.s.表示無統(tǒng)計學(xué)差異，*代表0.01

連續(xù)使用測試樣品區(qū)域的第14 d和28 d，測試樣品對眼角皺紋與對照組對比無顯著性差異(p>0.05)。

測量值：產(chǎn)品試樣的Sa 值越小，眼角皺紋粗糙度就越小。

連續(xù)使用測試產(chǎn)品靈芝保濕套裝 14 d后(見表6)，有57.58%的受試者感到肌膚緊實光滑，57.58%的受試者感到肌膚細(xì)膩有光澤，42.42%的受試者感到肌膚更柔軟了，51.52%的受試者感到細(xì)紋有改善，42.42%的受試者感到皺紋有改善，60.61%的受試者感到皮膚彈性有提升，66.67%的受試者感到皮膚有水潤感，有 66.67%的受試者覺得總體有改善，72.73%的受試者對產(chǎn)品的總體感到滿意。

表6 14 d后受試者自我評估

連續(xù)使用測試產(chǎn)品靈芝保濕套裝28 d后(見表7)，有 60.61%的受試者感到肌膚緊實光滑，57.58%的受試者感到肌膚細(xì)膩有光澤，51.52%的受試者感到肌膚更柔軟了，63.64%的受試者感到細(xì)紋有改善，60.61%的受試者感到皺紋有改善，51.52%的受試者感到皮膚彈性有提升，60.61%的受試者對產(chǎn)品的總體感到滿意。

表7 28 d后受試者自我評估

5 保濕基礎(chǔ)物質(zhì)與保濕機(jī)理

據(jù)文獻(xiàn)報道，對靈芝深層發(fā)酵液進(jìn)行高壓液相分析，對照各類化合物標(biāo)準(zhǔn)峰及特征峰，可大致得出靈芝深層發(fā)酵液中有較多的糖類、氨基酸或多肽類等，靈芝發(fā)酵液中多糖等物質(zhì)的含量要比空白基液及培養(yǎng)基多，對保濕增濕效果明顯。

5.1 靈芝多糖保濕機(jī)理 [13-14]

靈芝多糖一般由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖等單糖組成多糖。保濕作用機(jī)理：① 單與多糖分子中的羥基、羧基等極性基團(tuán)可與水形成氫鍵而結(jié)合大量的水分。多糖分子之間各種鏈相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有很強(qiáng)的固水作用。另外在多糖與皮膚中纖維狀蛋白質(zhì)共同組成含大量水分的膠狀基質(zhì)。② 多糖具有良好的成膜性能?？稍谄つw表面形成一層均勻的薄膜．減少皮膚表面的水分蒸發(fā)，使得水分從基底組織彌散到角質(zhì)層，保存皮膚自身的水分而完成潤膚作用。因此多糖的高吸水性和良好的成膜性完美結(jié)合，能為皮膚提供很好的保濕增濕效果。③ 多糖具有良好的成膜性能。靈芝深層發(fā)酵液中多糖等物質(zhì)能使水分從皮膚基底組織彌散到角質(zhì)層，保存皮膚自身的水分而起到潤膚作用，為皮膚提供很好的保濕增濕效果。

5.2 討論

(1)靈芝深層發(fā)酵液保濕效果明顯好于空白對照液。通過體內(nèi)法和體外法保濕效果綜合評價，及利用皮膚分析系統(tǒng)，進(jìn)行保濕效果對比，結(jié)果顯示靈芝深層發(fā)酵液保濕效果明顯優(yōu)于空白對照液。體外法中實驗結(jié)果表明靈芝深層深層發(fā)酵液保濕率高于未發(fā)酵液，表明靈芝深層發(fā)酵液保濕效果更加好，可進(jìn)一步加以利用和研究。

(2)靈芝深層中深層發(fā)酵液有較多的糖類、氨基酸或多肽類，且比未發(fā)酵液多，這些物質(zhì)中部分還有羥基與水分子形成氫鍵，達(dá)到鎖住水分達(dá)到保濕效果。靈芝發(fā)酵液具體成分及其保濕機(jī)理仍有待進(jìn)一步的研究。靈芝在發(fā)酵過程中發(fā)生怎樣的物質(zhì)變化，對皮膚保濕作用機(jī)理，起保濕作用的具體物質(zhì)，有待進(jìn)一步用實驗方法來論證。

6 展望

實驗證明靈芝經(jīng)過深層發(fā)酵后保濕效果有很大的提高，但對靈芝深層發(fā)酵液的深度開發(fā)還需進(jìn)一步研究和論證。有以下幾方面：

(1)可將靈芝發(fā)酵液以一定的形式和配比制成保濕水、保濕潤滑霜、面膜、抗皺增白霜等，發(fā)揮靈芝深層發(fā)酵液保濕增濕性能。為化妝品市場提供含中草藥成分的系列護(hù)膚品，物美價廉，安全可靠。

(2)通過高壓液相分析，靈芝深層發(fā)酵液中有效成分有糖類、氨基酸或多肽類等，但它們具體含量和結(jié)構(gòu)型式尚未完全清楚。應(yīng)繼續(xù)深入研究靈芝深層發(fā)酵前后具體成分變化，檢測其化學(xué)結(jié)構(gòu)，探討靈芝深層發(fā)酵液保濕機(jī)理。

(3)進(jìn)一步開發(fā)化妝品保濕功效評價方法，更能科學(xué)解釋皮膚保濕性能，完善評價方法，制定相關(guān)保濕標(biāo)準(zhǔn)。