陳小梅，龐莉娜，王志福

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122；2 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122

膿毒癥相關(guān)腦?。╯epsis-associated encephalopathy，SAE）是當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的全身性感染時(shí)，發(fā)生彌漫性腦功能障礙，可出現(xiàn)譫妄、意識(shí)不清，甚至是昏迷，是臨床膿毒癥后的一種嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥，SAE 增加了膿毒癥患者的死亡率，高達(dá)70%［1］；其可能的機(jī)制包括血管損傷和神經(jīng)炎癥，其中神經(jīng)炎癥是關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)因素，大量的小膠質(zhì)細(xì)胞激活在這一過程扮演核心角色［2-3］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞，監(jiān)測(cè)腦內(nèi)微環(huán)境并對(duì)其變化迅速做出反應(yīng)［4］。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌外膜的關(guān)鍵成分，可引起血漿和海馬炎癥因子增多，小膠質(zhì)細(xì)胞激活發(fā)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)，已廣泛應(yīng)用于膿毒癥的相關(guān)研究［5-6］。已有研究證實(shí)細(xì)胞因子，特別是腫瘤壞死因子（TNF-α）在LPS注射后1～3 h內(nèi)迅速產(chǎn)生，并通過受損的血腦屏障傳遞信號(hào)，腦內(nèi)的TNF-α 增加可激活海馬小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能，引起海馬形態(tài)和功能發(fā)生改變，出現(xiàn)急性認(rèn)知功能損傷［3，7-11］。

早期治療膿毒癥病人是預(yù)防腦損傷及隨后出現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵。已有研究證明，電針具有明顯的全身抗炎作用［12-14］，電針百會(huì)、神庭減輕神經(jīng)炎癥及改善認(rèn)知功能效果明確［15-17］。因此本研究擬探討電針百會(huì)、神庭是否通過下調(diào)系統(tǒng)炎癥、改善海馬區(qū)神經(jīng)炎癥，從而減輕內(nèi)毒素性腦損傷，改善認(rèn)知功能障礙。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康清潔級(jí)成年C57BL/6 雄性小鼠45 只，體質(zhì)量18～22 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。于自然晝夜交替和22～25 ℃室溫下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、內(nèi)毒素性腦損傷組（簡(jiǎn)稱模型組）和內(nèi)毒素性腦損傷＋電針組（簡(jiǎn)稱電針組），每組各15只。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷（深圳瑞沃德公司），戊巴比妥鈉（深圳瑞沃德公司），0.5 寸毫針（華佗牌30 號(hào)），HANS-200E 穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），脂多糖內(nèi)毒素（貨號(hào)：L2630，Sigma公司，美國(guó)），4%多聚甲醛，Iba-1 一抗（貨號(hào)：ab5076，Abcam），生物素標(biāo)記物二抗（貨號(hào)：ab150129，Abcam），TNF-α ELISA 試劑盒（貨號(hào)：MM-0132M2，福州沃森生物有限公司），Iba-1 ELISA 試劑盒（貨號(hào)：MM-44902M2，福州沃森生物有限公司），新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)裝置及動(dòng)態(tài)圖像采集分析系統(tǒng)（XR-XX117，福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)產(chǎn)業(yè)研究院），冰凍切片機(jī)（Thermo Scientific HM525 NX，福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)產(chǎn)業(yè)研究院）。

1.3 動(dòng)物模型制備

模型組和電針組腹腔注射LPS（貨號(hào)：L2630，Sigma 公司，美國(guó)）1 mg/kg，建立內(nèi)毒素性腦損傷；對(duì)照組給予同容量的溶劑。

1.4 干預(yù)方法

電針組進(jìn)行電針刺激，電針的穴位選取百會(huì)（頂骨正中，兩耳連線中點(diǎn)）、神庭（前正中線上，在額頂骨縫交界線前方處）（參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中的定位方法）；將無菌針灸針（直徑0.3 mm，長(zhǎng)13 mm，華佗牌針灸針）平刺入穴位1 mm，通過連接HANS-200E 穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），給予10 Hz 連續(xù)波，刺激強(qiáng)度為0.5 mA，于造模前15 min及行為學(xué)測(cè)試前各電針1次。對(duì)照組在同等條件下抓取后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療。模型組不干預(yù)。

1.5 www（what-where-when）行為學(xué)測(cè)試

根據(jù)行為學(xué)參考文獻(xiàn)［18］，分為適應(yīng)期和測(cè)試期，將小鼠置于1 個(gè)60 cm×60 cm×40 cm 的屏敝箱中，適應(yīng)后進(jìn)行正式測(cè)試期，任務(wù)分為3 個(gè)5 min 階段，每個(gè)階段試驗(yàn)間隔時(shí)間為50～55 min。第1 個(gè)階段為4個(gè)相同的A以三角形呈現(xiàn)的物體；第2個(gè)階段為4個(gè)相同的B排列成1個(gè)正方形；最后測(cè)試階段使用新的物體排列方式，將“B”物體（Recent B）仍然在角落處；1 個(gè)“A”物體（稱為Stationary A）停留在1個(gè)角落，而第2個(gè)A 物體（稱為Displaced A）則被放置在另一個(gè)角落。視頻由安裝在測(cè)試區(qū)域上方的攝像機(jī)錄制，采用三點(diǎn)動(dòng)態(tài)跟蹤法記錄與每個(gè)物體接觸的時(shí)間。測(cè)試階段的位置偏好被計(jì)算為“what”“where”“when”，計(jì)算公式為：

1.6 免疫組織化學(xué)染色

行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，立即腹腔注射麻醉，先用30 mL 的生理鹽水灌注，再用30 mL 4%的多聚甲醛灌注后取腦；取出后將腦浸泡在4%的多聚甲醛內(nèi)，4 ℃過夜，再換30%的蔗糖進(jìn)行脫水，沉底后立即在恒冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋切片，厚度為10 μm，將切好的組織片貼附在載玻片上；用PBS 洗3 次，每次5 min，擦凈切片組織周圍的水分（保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài)），滴加封閉液（按試劑盒規(guī)定的濃度配制），置于37 ℃箱1 h；后用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加山羊抗小鼠Iba-1 一抗（1∶200），濕盒4 ℃過夜；次日，用PBS 洗3 次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記驢抗山羊二抗（1∶200），37 ℃箱1 h；用PBS 洗3 次，每次5 min，擦去組織周圍的水分后，滴含DAPI 的封片劑，蓋上載玻片后，顯影拍片。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

LPS 注射后3 h各組采血，并行為學(xué)測(cè)試后各組取海馬組織勻漿離心，取上清液；用ELISA試劑盒測(cè)試血漿TNF-α、海馬Iba-1 和TNF-α 含量變化。操作方法：48 孔酶標(biāo)孔加樣，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品各100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃40 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6 次，濾紙印干；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白除外），將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃20 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6 次，濾紙印干；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板置37 ℃10 min，再次洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置于37 ℃暗處反應(yīng)15 min；每孔加入100 μL 終止液混勻，30 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 μm 波長(zhǎng)測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣品A值計(jì)算相應(yīng)TNF-α 和Iba-1含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.00 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用（）表示。采用方差分析進(jìn)行多組間比較，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針百會(huì)、神庭可提高LPS誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力

LPS 注射后24 h 行為學(xué)結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組比較，“what”“when”和“where”3 種記憶出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）；電針組與模型組比較，“what”和“when”2 種記憶明顯改善（P＜0.01），結(jié)果采用單因素方差分析，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 3組what-where-when行為學(xué)測(cè)試結(jié)果比較（）Figure 1 Comparison of exploring time on what-wherewhen behavior()

2.2 3組小鼠血漿TNF-α水平比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血漿的TNF-α 水平顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組小鼠血漿的TNF-α 水平明顯下降（P＜0.01），結(jié)果采用單因素方差分析，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 3組小鼠血漿TNF-α水平比較（）Figure 2 Comparison of plasma levels of TNF-α in mice()

2.3 3組海馬TNF-α水平比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)的TNF-α 水平顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組小鼠海馬區(qū)的TNF-α 水平明顯下降（P＜0.05），結(jié)果采用單因素方差分析，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 3組海馬TNF-α水平比較（）Figure 3 Comparison of hippocampal levels of TNF-α in mice()

2.4 3 組海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)及標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)比較

免疫熒光200 倍鏡下結(jié)果顯示，模型組相較于對(duì)照組，海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1 表達(dá)顯著增多，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后形態(tài)及數(shù)量改變明顯；而電針組與模型組比較，海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量顯著減少。見圖4。同樣，ELISA結(jié)果也顯示，模型組小鼠的海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1表達(dá)顯著增多（P＜0.01），而電針組與模型組比較，海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1 表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。見圖5。

圖4 3組海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)比較（×200）Figure 4 Comparison of expression of Iba-1 in the hippocampal region of three groups(×200)

圖5 3組海馬Iba-1水平比較（）Figure 5 Comparison of hippocampal levels of Iba-1 in mice of three groups()

3 討論

膿毒癥腦病主要是由系統(tǒng)性炎癥引起的神經(jīng)炎癥，從而造成腦損傷，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降等。海馬屬于邊緣系統(tǒng)的重要組成成分之一，參與高級(jí)認(rèn)知功能，尤其是對(duì)學(xué)習(xí)和記憶能力的儲(chǔ)存［8］，what-where-when 行為學(xué)測(cè)試是觀察小鼠對(duì)新物體的探索能力、位置辨別能力以及時(shí)序的記憶力［19］。已有研究顯示，LPS誘導(dǎo)全身炎癥后，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活，小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的常駐巨噬細(xì)胞，可造成腦內(nèi)神經(jīng)元的變性與死亡［20-21］。因此抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少全身及腦內(nèi)的炎癥水平是減輕膿毒癥腦病引起認(rèn)知功能下降的關(guān)鍵。有研究證明，電針百會(huì)、神庭可控制炎癥水平，改善認(rèn)知功能［17，22-23］。

本研究結(jié)果顯示，LPS注射后3 h，外周血TNF-α水平顯著上升，而電針可明顯降低其炎癥發(fā)展，發(fā)揮全身抗炎作用。LPS注射后24 h，模型組對(duì)新物體的探索及時(shí)序的記憶明顯受損，電針組可顯著改善記憶功能。免疫熒光及ELISA 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1 及TNF-α 表達(dá)明顯增多，小膠質(zhì)細(xì)胞異常增生，而電針組相較于模型組Iba-1、TNF-α表達(dá)降低，可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞異常增生。

因此，電針百會(huì)、神庭可以顯著改善膿毒癥腦病小鼠的新物體識(shí)別和時(shí)序記憶能力，并可減輕全身炎癥水平，減少海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，改善海馬區(qū)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，其作用可能通過抑制海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低外周血及海馬區(qū)炎癥因子TNF-α 釋放，從而改善系統(tǒng)性炎癥及其誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶能力下降。