劉 晶，曾維銓，林巧璇，盧莉銘，郭澤興，劉 洪，張良志，修忠標(biāo)，4

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州 350004；2 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建福州 350003；3 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州 350122；4 中醫(yī)骨傷及運(yùn)動康復(fù)教育部重點實驗室，福建福州350122

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）引起的疼痛及功能障礙嚴(yán)重影響著中老年患者的生活質(zhì)量。針刀療法作為中醫(yī)原創(chuàng)技術(shù)，能有效調(diào)節(jié)骨骼肌功能，改善KOA 疼痛和功能障礙［1］。筆者所在團(tuán)隊前期臨床研究也顯示，基于經(jīng)筋理論針刀循膝周經(jīng)筋病灶點松解能調(diào)整KOA 關(guān)節(jié)間隙，有效緩解疼痛和改善功能［2］，然而其作用機(jī)制尚不明確。骨骼肌慢性損傷后的愈合過程主要有炎癥、再生和纖維化3 個階段，結(jié)局是Ⅰ型膠原纖維（type Ⅰcollagen fibers，ColⅠ）、波形蛋白（vimentin，VIM）、α-肌動蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，影響骨骼肌功能［3-4］。針刀治療KOA 的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)骨骼肌慢性損傷纖維化有關(guān)，但目前還無相關(guān)報道。因此，本研究從股直肌纖維化的角度探討針刀治療KOA可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性6 月齡新西蘭大白兔24 只，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，訂購于上海松聯(lián)實驗動物責(zé)任有限公司［生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2017-0008］，委托福建省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心［SYXK（閩）2016-0005］代購并飼養(yǎng)。實驗動物單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)房溫度20～25 ℃，濕度30%～60%，自然光照，自由進(jìn)食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量進(jìn)行編號，并應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組、模型組和針刀組，每組8只。本實驗已通過福建省中醫(yī)藥研究院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（FJATCM-IAEC2019037），整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006 年頒布的有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），ColⅠ、VIM、α-SMA、β-actin、GAPDH 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），Trizol（美國Thermo公司），mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)），引物（上海生工生物工程股份有限公司），10%水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），4%多聚甲醛、10% EDTA、0.9%NaCl 注射液（南京丁貝生物有限公司）。一次性使用0.4 mm×40 mm 無菌小針刀（江西老宗醫(yī)醫(yī)療器械有限公司），DR 機(jī)（日本島津），3.0 T 高場強(qiáng)核磁共振（德國西門子），光學(xué)顯微鏡、自動脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、Leica 2025 石蠟切片（德國Leica 公司），高分子石膏（陜西安信醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)有限公司），普通石膏（浦江健宇衛(wèi)生材料有限公司），手術(shù)刀片及相關(guān)器械（上海醫(yī)療器械批發(fā)部有限公司），一次性包埋盒、包埋模具（上海源葉生物技術(shù)有限公司），黏附載玻片、蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

1.3 KOA兔模型制備及評價

采用改良Videman 法［5］將兔子仰臥于固定架上，膝前放置石膏托，高分子石膏繃帶單層螺旋纏繞，保持膝關(guān)節(jié)伸直中立位0°，踝關(guān)節(jié)背曲60°，最后使用防啃咬繃帶環(huán)形纏繞高分子石膏表面。造模6周后Lequesne MG 膝關(guān)節(jié)級別評分增高，經(jīng)X線和MRI 影像學(xué)檢測提示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨面欠光滑，股直肌張力增高，髕上1～3 cm 股直肌周圍可觸及條索或硬節(jié)為模型成功。

1.4 干預(yù)方法

造模成功1 周后，針刀組依據(jù)《中國經(jīng)筋學(xué)》［6］膝關(guān)節(jié)經(jīng)筋病灶點命名及定位，根據(jù)兔的骨度分寸，選取治療點“鶴頂次”（足陽明經(jīng)筋病灶點，股四頭肌肌腱髕骨正上緣附著處）、“髕外上”（足陽明經(jīng)筋病灶點，股外側(cè)肌肌腱髕骨外上緣附著處）、“髕內(nèi)上”（足陽明經(jīng)筋病灶點，股內(nèi)側(cè)肌肌腱髕骨內(nèi)上緣附著處），在施術(shù)部位，用活力碘消毒3遍，然后鋪無菌洞巾，使治療點正對洞巾中間，術(shù)者戴好無菌手套，采用一次性使用0.4 mm×40 mm 無菌小針刀進(jìn)行松解，刀口線垂直皮膚進(jìn)針刀，針刀抵達(dá)病變處行提插刀法松解，范圍不超過0.5 cm，操作結(jié)束后用無菌干棉球在手術(shù)部位按壓1 min，見圖1。每7 d干預(yù)1 次，干預(yù)4 次。空白組和模型組只做同樣的抓取和固定，不予針刀治療。

圖1 針刀治療過程Figure 1 Operating processes of acupotomy

1.5 指標(biāo)檢測及方法

1.5.1 Masson 染色 于針刀干預(yù)結(jié)束后1 周，麻醉下耳緣靜脈空氣栓塞處死，迅速解剖左側(cè)膝關(guān)節(jié)，行髕前正中切口，逐層分離至關(guān)節(jié)囊，用尖刀切斷股四頭肌在髕骨上緣附著處肌腱，分離股直肌，迅速取髕上1～3 cm 股直肌，用生理鹽水清洗、濾紙吸干后，投入4%多聚甲醛中固定24 h，固定后用流水沖洗標(biāo)本4 h，脫水、包埋，以厚度5 μm 制備組織切片。將組織切片置于60 ℃烘箱中干燥30 min后，常規(guī)脫蠟至水；隨后用配置好的Weigert鐵蘇木素染色5 min；酸性乙醇分化液分化5 s，水洗，藍(lán)化液反藍(lán)5 min，蒸餾水沖洗，麗春紅酸性復(fù)紅液復(fù)紅5～10 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液水洗1 min，苯胺藍(lán)染色1～2 min，弱酸工作液水洗1 min。95%酒精、無水酒精、二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察并拍照，用Image J圖像分析軟件分析計算膠原容積分?jǐn)?shù)。

1.5.2 RT-PCR 針刀干預(yù)結(jié)束1周后，取兔股直肌組織，在研缽中加入液氮快速研磨，裝入預(yù)冷的EP管，加入1 mL Trizol，吹打，室溫靜置5 min；提取總RNA，核酸紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度；取總RNA 3 μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用MMLV-PCR 擴(kuò)增試劑盒反轉(zhuǎn)錄二步法，cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR 反應(yīng)體系中含標(biāo)本體系3 μL，引物體系17 μL，總體系20 μL。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計，引物序列：GAPDH，正向：TGGAATCC ACTGGCGTCTTCAC，反向：AGGATGCGTTGCTGAC AATCTTGA；ColⅠ，正向：AGGAACCAAGGGACCTA AG，反向：CCAGGGAAACCAGTCATAC；VIM，正向：TGGACATTGAGATCGCCACC，反向：GAGTGGGTG TCAACCAGAGG；α-SMA，正向：GTCAGGAATCCC GTGAAGCA，反向：CATTGTCACACACAAGGGCG。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，72 ℃30 s，共40個循環(huán)。用相對定量2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.5.3 Western blot 組織裂解法提取兔股直肌組織總蛋白，BCA法測定蛋白含量后，SDS-PAGE 凝膠電泳，NC 膜轉(zhuǎn)印，一抗、二抗孵育，ECL 顯色曝光。Gel Doc 2000 凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 或GAPDH 作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/βactin 或GAPDH 條帶灰度值來表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組兔股直肌Masson染色形態(tài)學(xué)比較

空白組可見整齊的被紅染的骨骼肌纖維；模型組可見骨骼肌纖維破壞，被大量藍(lán)染的膠原纖維包繞；針刀組可見骨骼肌纖維較為整齊，被少量藍(lán)染的膠原纖維包繞。與空白組比較，模型組股直肌膠原容積分?jǐn)?shù)增加（P＜0.01）；與模型組比較，針刀組股直肌膠原容積分?jǐn)?shù)減?。≒＜0.01）。見圖2。

圖2 3組兔股直肌Masson染色形態(tài)學(xué)比較Figure 2 Comparison of Masson stain in rectus femoris tissue of three groups

2.2 3 組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA 表達(dá)比較

見表1。

表1 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA表達(dá)比較（）Table 1 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA mRNA expression in rectus femoris tissue of three groups（）

表1 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA表達(dá)比較（）Table 1 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA mRNA expression in rectus femoris tissue of three groups（）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。Notes:Compared with the blank group,1)P＜0.01.Compared with the model group,2)P＜0.01.

2.3 3 組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA 蛋白表達(dá)比較

見圖3和表2。

表2 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白表達(dá)的比較（）Table 2 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA protein expression in rectus femoris tissue of three groups（）

表2 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白表達(dá)的比較（）Table 2 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA protein expression in rectus femoris tissue of three groups（）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。Notes:Compared with the blank group,1)P＜0.01.Compared with the model group,2)P＜0.01.

圖3 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白條帶顯影Figure 3 Protein band development of ColⅠ,VIM and α-SMA in rectus femoris tissue of three groups

3 討論

近年來普遍認(rèn)為骨骼肌慢性損傷引起的筋骨失衡是導(dǎo)致KOA 疼痛和功能障礙的重要機(jī)制［7-8］。研究表明異常姿勢、外傷等均可引起膝關(guān)節(jié)骨骼肌慢性損傷［9-10］。骨骼肌纖維化在慢性骨骼肌損傷中扮演重要角色，當(dāng)骨骼肌損傷出現(xiàn)后，機(jī)體在自我修復(fù)過程中，肌衛(wèi)星細(xì)胞會過早分化成熟，促進(jìn)生肌祖細(xì)胞向纖維祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致ColⅠ、VIM、α-SMA 等細(xì)胞外基質(zhì)沉淀，出現(xiàn)骨骼肌纖維化，影響骨骼肌功能［11］，該過程受到Wnt 通路、TGF-β 通路、CTGF通路等一系列復(fù)雜的調(diào)控［12］。

研究表明推拿、針刺等方法干預(yù)能夠促進(jìn)骨骼肌纖維化的修復(fù)，但目前臨床缺乏治療KOA 慢性骨骼肌纖維化的有效手段［13-14］。

調(diào)節(jié)骨骼肌功能和恢復(fù)筋骨平衡是改善KOA疼痛及功能障礙的有效途徑［15-16］。中醫(yī)經(jīng)筋理論深刻揭示了肌肉骨骼系統(tǒng)之間內(nèi)在聯(lián)系，從力學(xué)角度闡釋KOA“橫絡(luò)痹阻、筋骨失衡”的核心病機(jī)。針對經(jīng)筋病機(jī)及病候特點，總結(jié)了“以痛為腧”和“橫絡(luò)解結(jié)”的治療方法。針刀最主要的功效在于松解軟組織粘連、瘢痕，切割攣縮，疏通堵塞，調(diào)節(jié)力學(xué)平衡［17-18］。因此，基于經(jīng)筋理論針刀對KOA 筋骨失衡模式下足三陽、足三陰經(jīng)筋在膝部常見筋結(jié)點的松解，從而恢復(fù)筋骨平衡，達(dá)到“筋柔骨正，調(diào)筋治骨”的目的［19］，治療KOA 取得確切療效［20-21］。股四頭肌是伸膝裝置重要組成部分，KOA 發(fā)病與股四頭肌功能下降等密切相關(guān)，通過松解股四頭肌病灶點和加強(qiáng)肌力訓(xùn)練，可有效緩解KOA 患者膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙［22-23］。股直肌連接了髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)，當(dāng)髖膝聯(lián)動功能失常、下肢力線失衡，股直肌將會更容易受累而發(fā)病［24］。因此，本研究探討基于經(jīng)筋理論針刀松解股四頭肌經(jīng)筋病灶點對股直肌病變的影響，以揭示針刀治療KOA可能的作用機(jī)制。

本項實驗通過復(fù)制KOA 兔模型發(fā)現(xiàn)股直肌纖維化明顯，基于經(jīng)筋理論針刀松解股四頭肌經(jīng)筋病灶點能下調(diào)KOA 股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)，減輕股直肌纖維化程度。針刀促進(jìn)KOA 股直肌纖維化修復(fù)較推拿、針刺等具有明顯的優(yōu)勢：針刀具有“刀割”和“針刺”的雙重作用，一方面，針刀通過松解骨骼肌粘連、瘢痕、攣縮，疏通堵塞，改善局部血液循環(huán)和力學(xué)環(huán)境，有利于骨骼肌纖維的再生和膠原纖維的降解［25］；另一方面，針刀較強(qiáng)的刺激作用可能激活人體修復(fù)系統(tǒng)，能促進(jìn)骨骼肌的修復(fù)，從而修復(fù)KOA 骨骼肌的功能，調(diào)節(jié)筋骨平衡［26］。