陳秋欣，孔 瑩，于婷婷，張 瑜，劉 鵬，張 鑫

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150001；3 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001；4 深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)），廣東深圳518133

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是卒中的亞型之一，占全部卒中類型的15%～20%，其死亡率和病殘率較高［1-2］。隨著人口老齡化速度的加快，其發(fā)病率持續(xù)上升［3］。腦出血后多數(shù)患者遺留有運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言、感覺(jué)、吞咽功能的障礙，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。盡管近些年關(guān)于腦出血治療的臨床和實(shí)驗(yàn)研究有所增加，但仍未找到有效的治療方法［4］。目前多項(xiàng)研究表明，血腫本身引起的機(jī)械性損傷、血腫分解產(chǎn)物的繼發(fā)性毒性及炎性損傷是腦出血最主要的病理、生理改變［5-10］。腦出血后血紅蛋白破入到腦局部引起繼發(fā)性血腦屏障破壞，局灶性水腫以及神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡等［11］。同時(shí)，腦出血引起的氧化損傷可以繼續(xù)激活腦組織中炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放。血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是一種抗氧化酶，在氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)起到清除氧自由基片段的作用［12-13］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）在腦出血炎性反應(yīng)中起中心調(diào)控作用，多種炎性因子如白介素6（Interleukin-6，IL-6）、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等均為其下游因子，與神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密［14］。

我們既往研究顯示，針刺百會(huì)透曲鬢穴可以抑制TLR-4、NF-κB 蛋白的表達(dá)，降低血腫組織中促炎因子TNF-α、IL-6 的含量，減輕腦出血后炎性損傷，改善大鼠神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮腦保護(hù)作用［15-17］。但從HO-1 與炎性因子角度討論針刺對(duì)腦出血的保護(hù)作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用針刺百會(huì)透曲鬢穴干預(yù)腦出血大鼠，觀察針刺對(duì)血腫組織HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達(dá)影響，探討針刺治療腦出血的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量（300±20）g［吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（吉）2013-0004］。動(dòng)物于人工控制條件下，溫度（22±3）℃、相對(duì)濕度（60±5）%、12/12明暗變化條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

HO-1多克隆抗體（bs-0827R-1，上海振譽(yù)生物科技有限公司，中國(guó)）；NF-κB兔多克隆抗體（BM3940，武漢博士德生物有限公司）；IL-1β 多克隆抗體（70-ab33591-200，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)）；TGF-β 多克隆抗體（70-ab35829-050，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)）；立體定位儀（ST-5ND-C，中國(guó)成都儀器廠）；電泳儀（DYY-7C，北京六一生物科技有限公司）。

1.3 造模方法

參照文獻(xiàn)［18］制作腦出血大鼠模型。將大鼠用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，備皮消毒，正中切口，骨膜剝離器剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，取前囟點(diǎn)（Bregma 點(diǎn)）右旁開(kāi)3.5 mm，后0.2 mm 定點(diǎn)，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm 的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3 cm 處剪斷鼠尾，用微量注射器取血50 μL，將微量注射器固定于立體定位儀上，沿鉆孔進(jìn)針約6 mm，將未肝素化的血液50 μL以20 μL/min速度推進(jìn)尾殼核，留針約5 min，緩慢出針。留針期間酒精棉球包扎鼠尾斷端傷口，術(shù)后局部噴灑慶大霉素，用牙科水泥封閉顱骨傷口，縫合頭皮，局部皮膚采用碘酚消毒。假手術(shù)組動(dòng)物接受類似模型組的各項(xiàng)手術(shù)操作，但不進(jìn)行注血。造模完成至大鼠清醒后，采用Berderson 評(píng)分法［19］確定動(dòng)物成功模型。評(píng)分1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組及干預(yù)方法

將108 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、針刺組。每組按1、3、7 d時(shí)間點(diǎn)再分為3個(gè)亞組，每組各12 只。①假手術(shù)組：接受類似模型組的各項(xiàng)手術(shù)操作，但不進(jìn)行注血制作。②模型組：僅接受腦出血模型制作，不進(jìn)行任何干預(yù)。③針刺組：制作腦出血模型。造模后12 h 開(kāi)始治療。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［20］選取大鼠百會(huì)穴、患側(cè)曲鬢穴，采取百會(huì)（頂骨正中）穴透刺曲鬢穴（右眶外緣與右外耳門連線的后2/3），手持針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州安迪）快速進(jìn)針，并向右下方曲鬢穴透刺，進(jìn)針深度20 mm，以100 r/min小幅度捻轉(zhuǎn)。每間隔5 min捻針1 次，每次持續(xù)捻轉(zhuǎn)5 min，共留針30 min，每日1次。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

術(shù)后1、3、7 d，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)，各組取6 只大鼠行HE 染色檢測(cè)腦組織病理?yè)p傷，取6 只大鼠行Western blot 檢測(cè)腦組織HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表達(dá)。

1.5.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià) 采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified Neurological Severity Score，mNSS）對(duì)3組大鼠的神經(jīng)功能損傷進(jìn)行檢測(cè)［21-22］。

1.5.2 HE 染色檢測(cè)腦組織病理?yè)p傷 灌注后，取注血中心點(diǎn)前后2 mm的大鼠腦組織，包埋，冠狀切片，厚4 μm，每隔2 mm連續(xù)切6個(gè)腦片，HE染色，光鏡下觀察病理?yè)p傷。

1.5.3 Western blot 檢測(cè)腦組織HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達(dá) 從-80 ℃冰箱取各組的腦組織，將腦組織勻漿離心后取上清液，采用BCA 法測(cè)定蛋白量。30 μL 處理后的蛋白樣品采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PACE）轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker 為參照，5%脫脂奶粉封閉，相應(yīng)條帶分別加入HO-1（1∶500）、NF-κB（1∶1 000）、IL-1β（1∶500）、TGF-β（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜。顯色完成后，將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中終止顯色。用濾紙將膜吸干，避光放置20 min 后，將膜置于掃描儀中掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料服從正態(tài)分布均以（）表示。各時(shí)間組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組mNSS評(píng)分比較

評(píng)分前所有大鼠mNSS 評(píng)分均為0 分。假手術(shù)組術(shù)后無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。模型組大鼠于1 d時(shí)已表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，3 d和7 d時(shí)仍有明顯神經(jīng)缺損癥狀；與模型組相比，針刺組各時(shí)間大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 3組mNSS評(píng)分比較（）Table 1 Comparison of mNSS scores of rats in three groups（）

表1 3組mNSS評(píng)分比較（）Table 1 Comparison of mNSS scores of rats in three groups（）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。Notes:Compared with the sham operation group,1)P＜0.01;compared with the model group,2)P＜0.01.

2.2 3組大鼠HE染色結(jié)果

1、3、7 d時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組大鼠基底節(jié)區(qū)可見(jiàn)正常的神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞。模型組大鼠在造模1 d后可見(jiàn)出血灶；術(shù)后3 d 出血灶增大，腦組織病理結(jié)構(gòu)破壞明顯；術(shù)后7 d 可見(jiàn)血腫范圍減少。與模型組相比，各時(shí)間點(diǎn)針刺組出血灶范圍縮小，腦組織病理結(jié)構(gòu)破壞程度降低。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining results of rats in three groups

2.3 3組大鼠腦組織HO-1蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組可見(jiàn)HO-1 弱陽(yáng)性表達(dá)。模型組HO-1 蛋白表達(dá)增高，于3 d 時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)最多。與模型組相比，于3、7 d 時(shí)間點(diǎn)針刺組HO-1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠腦組織HO-1 Western blot結(jié)果Figure 2 HO-1 Western blot results of brain tissue of rats in three groups

2.4 3 組大鼠腦組織NF-κB、TGF-β 和IL-1β 蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組均可見(jiàn)NF-κB、TGF-β 和IL-1β 弱陽(yáng)性表達(dá)；各時(shí)間點(diǎn)模型組NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表達(dá)明顯增高，于3 d 時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)最多；與模型組相比，針刺組在1、3、7 d 時(shí)間點(diǎn)NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3～5。

圖3 3組大鼠腦組織NF-κB Western blot結(jié)果Figure 3 NF-κB Western blot results of brain tissue of rats in three groups

圖4 3組大鼠腦組織TGF-β Western blot結(jié)果Figure 4 TGF-β Western blot results of brain tissue of rats in three groups

圖5 3組大鼠腦組織IL-1β Western blot結(jié)果Figure 5 IL-1β Western blot results of brain tissue of rats in three groups

3 討論

腦出血屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，針灸治療中風(fēng)在臨床應(yīng)用多年，并取得較好的臨床療效［23］。一項(xiàng)Meta 分析表明針灸治療腦出血急性期療效肯定［24］。早在春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期，已有扁鵲取穴三陽(yáng)五會(huì)即百會(huì)穴用來(lái)治病的案例。古籍《乾坤生意》中對(duì)于中風(fēng)病的治療無(wú)論是風(fēng)邪入腑還是風(fēng)邪入臟均選用百會(huì)穴治療。曲鬢穴，屬足少陽(yáng)膽經(jīng)。采用百會(huì)透刺曲鬢穴，這一穴區(qū)橫跨頂、額、顳3 區(qū)，此區(qū)內(nèi)含督脈、足太陽(yáng)膀胱經(jīng)及足少陽(yáng)膽經(jīng)，其經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)可縱貫全身，主治中風(fēng)、腦病、感覺(jué)不利等。臨床研究亦表明針刺百會(huì)透曲鬢穴能夠改善中風(fēng)患者的神經(jīng)功能缺損程度，提高臨床療效［25］。實(shí)驗(yàn)研究也表明早期針刺能促進(jìn)血管新生及神經(jīng)再生，且較長(zhǎng)針刺時(shí)間對(duì)腦出血后血腦屏障有正向保護(hù)作用，說(shuō)明針刺能夠起到腦保護(hù)的作用［26-27］。

腦出血后腦損傷的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，目前主要分為原發(fā)性損害和繼發(fā)性損害。原發(fā)性損害是指血腫對(duì)局部腦組織破壞，繼發(fā)性損害是指腦出血后腦組織對(duì)血腫及其釋放的血酶、血紅蛋白等化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致腦組織水腫、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等［28-29］。腦出血后，大量血紅蛋白破入腦實(shí)質(zhì)，血紅素作為血紅蛋白分解產(chǎn)物能夠產(chǎn)生氧自由基和氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)神經(jīng)元死亡［30］。

作為人體內(nèi)血紅蛋白分解產(chǎn)物——血紅素分解的限速酶，HO-1 發(fā)揮著重要作用，諸多研究均已證實(shí)，通過(guò)不同藥物或途徑激活HO-1 的活性，均能使其炎癥損傷減輕，反之，抑制其活性則能夠加重神經(jīng)損傷［31-32］。目前對(duì)于HO-1 在腦出血中作用仍存在爭(zhēng)議，WANG 等［33］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HO-1 在腦出血中同時(shí)發(fā)揮抗氧化和促氧化作用。腦出血后第1～7天HO-1表達(dá)的增加起到了保護(hù)作用，而7 d后HO-1 的過(guò)度表達(dá)則可加重神經(jīng)功能損傷。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在腦出血早期即可觸發(fā)HO-1 的神經(jīng)保護(hù)作用，可能與HO-1 誘導(dǎo)的Nrf2 和NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核的調(diào)節(jié)有關(guān)［34］。亦有研究表明HO-1通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)來(lái)抑制NF-κB 的活化［35］。由此可見(jiàn)，HO-1與NF-κB 及相關(guān)炎性因子存在緊密又復(fù)雜的關(guān)系。

多年來(lái)，炎性反應(yīng)一直是腦出血的重要病理生理機(jī)制［36-37］，作為具有多種功能且廣泛存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 靜息狀態(tài)下無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到如應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞因子等刺激后，NFκB 即可解除抑制而被活化釋放，迅速進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)特異靶基因的轉(zhuǎn)錄。可將NF-κB 看作炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)開(kāi)關(guān)，能夠觸發(fā)多種細(xì)胞因子和黏附分子等的表達(dá)，如IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6等［38-39］。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明炎癥反應(yīng)介質(zhì)IL-1β、TGF-β與腦出血后繼發(fā)性腦損害密切相關(guān)［40-45］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)mNSS 評(píng)分法觀察到模型組腦出血大鼠各時(shí)間點(diǎn)（1、3、7 d）出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損癥狀，在術(shù)后第3 天時(shí)模型組大鼠神經(jīng)缺損癥狀相對(duì)最重，評(píng)分最高。直至術(shù)后7 d大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀減輕。針刺組大鼠各時(shí)間點(diǎn)（1、3、7 d）神經(jīng)功能評(píng)分與模型組相比明顯降低，說(shuō)明針刺能夠降低腦出血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，改善神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。模型組造模1 d 后出現(xiàn)血腫，周圍組織破壞明顯，術(shù)后3 d 可見(jiàn)出血灶范圍增大，7 d 時(shí)出血灶減小，腦組織水腫減輕；針刺組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)與模型組比較病變程度均有所減輕，說(shuō)明針刺可以有效地減輕腦出血大鼠的腦組織病理炎性損傷。Western blot 結(jié)果可見(jiàn)模型組HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表達(dá)均不同程度增高，相比模型組而言，針刺組各時(shí)間點(diǎn)（1、3、7 d）HO-1 蛋白表達(dá)增高，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明針刺可以促進(jìn)HO-1的表達(dá)；而針刺組各時(shí)間點(diǎn)（1、3、7 d）NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達(dá)明顯減少，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明針刺能夠抑制NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表達(dá)。

綜上，針刺百會(huì)透曲鬢穴可能通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)，抑制NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達(dá)，降低病理炎癥損傷，改善神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。但針刺如何通過(guò)HO-1調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路及其下游因子表達(dá)，以及HO-1 在腦出血中具體發(fā)揮什么樣的作用，仍需要人們進(jìn)一步的深入研究，以期為臨床改善腦出血患者的治療找到新的思路。