陳思思 張夢華 王錦秀 張憲春

摘 要：? 清代《植物名實圖考》中記載的傳統(tǒng)草藥千層塔，之前被考證為石松科（Lycopodiaceae）石杉屬（Huperzia Bernh）植物蛇足石杉（Huperzia serrata）。目前藥學(xué)研究從中分離出的石杉堿甲，能夠高效、高選擇、可逆地抑制乙酰膽堿酯酶，減少乙酰膽堿分解，已廣泛應(yīng)用于改善記憶和治療阿爾茨海默病，引起了世界的廣泛關(guān)注。該文綜述了國內(nèi)外近40年來有關(guān)“蛇足石杉”在系統(tǒng)與分類學(xué)、遺傳多樣性、組學(xué)研究、內(nèi)生真菌、化學(xué)成分、資源調(diào)查、栽培繁殖和資源保護等方面的研究進展，并從植物分類學(xué)研究角度出發(fā)，厘清原中國境內(nèi)分布的蛇足石杉，實應(yīng)為我國東北地區(qū)分布的Huperzia serrata和我國南方分布較廣的H. javanica兩個物種;該研究結(jié)果顯示，《植物名實圖考》千層塔的基原，應(yīng)是我國南方廣布的石杉屬植物H. javanica?？紤]到藥用植物和藥材名稱的穩(wěn)定，將H. javanica的中文名沿用《植物名實圖考》中的“千層塔”，H. serrata的中文名處理為“蛇足石杉”。

關(guān)鍵詞： 蛇足石杉， 千層塔， 阿爾茨海默病， 基原物種， 自然資源保護

中圖分類號：? Q949

文獻標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）11-1794-16

Original plant and research progress of the

medicinal plant Huperzia javanica

CHEN Sisi1，2， ZHANG Menghua1，2， WANG Jinxiu1， ZHANG Xianchun1*

（ 1. State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany， Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences，

Beijing 100093， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China ）

Abstract：? The traditional herbal medicine Qiancengta， recorded in the Iconographia Plantarum written in the Qing Dynasty， was previously verified as Lycopodiaceae， Huperzia Bernh，? Huperzia serrata. Huperzine A （HupA）， isolated from Qiancengta during pharmaceutical research， can effectively， highly selectively and reversibly inhibit acetylcholinesterase and reduce the decomposition of acetylcholine. It has been widely used to enhance memory and treat Alzheimer’s disease， attracting worldwide attention. This research reviews the latest research progress of these precious medicinal plants in the past 40 years， including systematics，? genetic diversity， omics research， endophytic fungi， chemical constituents， resource investigation， cultivation and propagation and natural resource conservation. From the perspective of taxonomy， H. serrata in China includes actually two species： H. javanica in South China and H. serrata in Northeast China. The former is the botanical origin recorded in Iconographia Plantarum. Taking into account the stability of the names of medicinal plants and materials， this research propose that the Chinese name of H. javanica follows “Qiancengta” in Iconographia Plantarum and H. serrata follows “Shezushishan”.

Key words： Huperzia serrata， H. javanica， Alzheimer’s disease， original plant， natural resource conservation

千層塔是我國傳統(tǒng)名貴中草藥，又名蛇足草、金不換等（羅超等，2011），最早以中文名“千層塔”載于清代《植物名實圖考》（吳其濬，1848）中，具解毒、除濕、消瘀、止血等功效（楊純瑜，1982）。20世紀(jì)80年代，我國科學(xué)家首次從千層塔中提取出石杉堿甲（Huperzine A， HupA）（俞超美等，1982）;1991年，石杉堿甲治療記憶障礙的作用被發(fā)現(xiàn)（Xu et al.， 1995）。目前，石杉堿甲已廣泛應(yīng)用于治療老年性記憶衰退、認知障礙（胡玉萍和袁德培，2009;Ohba et al.， 2015;Takeshi & Nobutoshi， 2018）和阿爾茨海默?。∣rhan et al.， 2011;Desilets et al.， 2009），同時它還具有抗癲癇、麻醉和有機磷解毒等作用（胡玉萍和袁德培，2009;Ohba et al.， 2015;Takeshi & Nobutoshi， 2018），在美國作為一種膳食補充劑上市（Orhan et al.， 2011;Crawford et al.， 2020）。

隨著全球人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病已成為危害老年人健康的第四大疾病，也是所需醫(yī)療費用最高的。我國65歲以上的老年群體中，阿爾茨海默病發(fā)病率為5.0%～8.0%，80歲以上發(fā)病率可達21.0%（張菁華，2020）。千層塔已是我國治療阿爾茨海默病的重要藥源，但由于千層塔生長周期長，生長緩慢，植株矮小，石杉堿甲含量甚微（僅約0.02%）（孫遠明等，2002），現(xiàn)有野生資源遠遠不能滿足藥物提取的需求。因此，合理地開發(fā)和持續(xù)利用這一珍貴的藥用植物資源是當(dāng)今亟待解決的問題。因此，我們整理了自20世紀(jì)80年代至今有關(guān)蛇足石杉的研究論文進行分析，并以此來探討該植物必要的保護措施和未來的研究方向。文獻來源于中國知網(wǎng)、Web of Science、PubMed、ResearchGate等知名文獻檢索網(wǎng)站，共檢索到與千層塔[多采用了蛇足石杉（Huperzia serrata）這一名稱]有關(guān)的研究論文共630篇。其中，中文413篇，英文217篇，主要研究內(nèi)容分布見圖1。

1 蛇足石杉和近緣物種的系統(tǒng)與分類

1.1 系統(tǒng)和分類

根據(jù)最新的石松類和蕨類分類系統(tǒng)，蛇足石杉屬于石松科（Lycopodiaceae）石杉亞科（Huperzioideae）石杉屬（Huperzia Bernh）（Group et al.， 2016）。據(jù)《中國植物志》（張麗兵，2004）記載，蛇足石杉的學(xué)名為Huperzia serrata，其異名有10余個。Shrestha & Zhang（2015）首次對蛇足石杉復(fù)合群進行了形態(tài)計量學(xué)和生態(tài)位模擬分析，結(jié)果支持蛇足石杉復(fù)合群包括4個物種的分類處理，即H. serrata、H. javanica、皺邊石杉（H. crispata）和南嶺石杉（H. nanlingensis）（圖2，圖3）。

Huperzia javanica和H. serrata的分類問題長期未能解決。Makino （1898）將H. javanica處理為H. serrata的變種（Lycopodium serratum var. javanicum）。秦仁昌（1981）又將Huperzia javanica處理為H. serrata的長柄變型（H. serrata f. longipetiolata）。楊純瑜（1982）認為H. serrata f. longipetiolata的葉柄較長，主要分布于中國南方且具有更高的石杉堿甲含量，這些特征明顯區(qū)別于原變種，因此將其提升為長柄石杉（H. longipetiolata）。隨后，楊純瑜（1989）認為H. longipetiolata的形態(tài)特征和模式與產(chǎn)自爪哇的H. javanica一致，于是將它們進行了歸并。Lim et al. （2015）根據(jù)葉緣鋸齒數(shù)量和珠芽苞片形態(tài)特征將H. javanica 和H. serrata歸類為兩個不同物種。

姬生國等（2007）采用葉綠體片段matK探討10種石杉屬植物的系統(tǒng)發(fā)育及分子鑒定，結(jié)果表明H. serrata與H. longipetiolata分別在不同分支。Ji et al. （2008）基于rbcL和psbA-trnH構(gòu)建了石松科25個物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果表明皺邊石杉和南川石杉（H. nanchuanensis）為姐妹關(guān)系，H. serrata和H. serrata var. longipetiolata為姐妹關(guān)系，該結(jié)果與此前基于matK構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果不一致。Zhang et al. （2017）基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建了H. serrata和H. javanica的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果支持H. serrata和H. javanica為兩個不同的物

種（圖4），并且與H. javanica相比，H. serrata同北美的亮葉石杉（H. lucidula）的關(guān)系更近。

1.2 “千層塔”原植物的學(xué)名考證

“千層塔”最早的圖文描述記載于清代吳其濬的《植物名實圖考》（圖5），“千層塔，生山石間。蔓生綠莖，小葉攢生，四面如刺，間有長葉及梢頭葉，俱如初生柳葉?？杉逑茨[毒、跌打及鼻孔作癢”。《新華本草綱要》最早考證“千層塔”基原為蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.） Trev.]（吳征鎰等，1990），并被沿用至今。

吳其濬為河南固始縣人，清代河南唯一的狀元，一生“宦跡半天下”，其所著《植物名實圖考》共記錄湖南、湖北、江西、云南、貴州、福建、山西等19個省的植物，其原文雖然未記錄“千層塔”產(chǎn)地，但是第十六卷新描述的物種，多為江西植物，故推測“千層塔”產(chǎn)江西。又據(jù)繪圖，該植物葉片較大，葉片橢圓形或倒闊披針形，中部最寬，葉緣鋸齒稀疏，顯然不同于東北地區(qū)分布的H. serrata，其葉片狹窄，披針形，中部不明顯寬闊，葉緣鋸齒較密。因此，本研究認為，《植物名實圖考》描述記錄的“千層塔”，應(yīng)是我國南方分布的H. javanica，而非北方的H. serrata。

過去文獻記載的H. serrata多采用了廣義蛇足石杉物種概念，實則包括了H. javanica和H. serrata這2個種，研究材料多來自我國南方省份，在分類上應(yīng)該是H. javanica。雖然H. javanica的中文名也曾采用過“長柄石杉”（王峻和潘勝利，2005;宋育紅等，2010;王小理等，2007），但是考慮到藥用植物和藥材名稱的穩(wěn)定，宜將南方廣布的產(chǎn)石杉堿甲的H. javanica的中文名，沿用清代本草名“千層塔”;北方分布的不產(chǎn)石杉堿甲或含量很低的H. serrata 的中文名使用“蛇足石杉”。地理分布上二者具有明顯的地理替代，H. javanica（千層塔）主產(chǎn)我國長江以南地區(qū)，以及東南亞熱帶和亞熱帶山地，而H. serrata（蛇足石杉）分布于我國華北和東北地區(qū)，以及俄羅斯遠東地區(qū)、朝鮮半島和日本中北部溫帶和寒溫帶山地（圖6）。

因此，以往文獻中普遍使用的“蛇足石杉” “Huperzia serrata”等植物名稱，應(yīng)按照最新的分類處理，這些產(chǎn)自我國南方省份的“蛇足石杉”其實都是千層塔（H. javanica）植物。

1.3 中國蛇足石杉復(fù)合體的分類

中國蛇足石杉復(fù)合體的主要鑒別特征、分布和生境描述如下。

1.3.1 皺邊石杉 Huperzia crispata （Ching） Ching in Acta Bot. Yunnan. 3（3）： 293.1981. Type： China， Sichuan， Emei Shan， C. H. Hsiung 91099 （paratype， IBSC-590811）.

Lycopodium crispatum Ching in Acta Phytotax. Sin. 18（2）： 236， pl. 1， f. 3. 1980.

莖直立或斜升，株高20～50 cm， 莖粗1.6～4 mm。小枝最寬處2.8～4.3 cm，最窄處1.6～2.5 cm。孢子葉和營養(yǎng)葉同形，葉密集，有光澤，著生在莖上呈直角;葉狹橢圓形，葉最寬的部分在中部，葉長12～20 mm，葉寬1.5～2.5 mm;葉片背面中脈突出明顯;葉基楔形，下延，有柄;葉邊緣皺曲，呈重鋸齒狀，強度卷縮，葉尖漸尖。

分布：重慶、廣東、廣西、貴州、湖北、江西、四川和云南。

生境：生于林下潮濕處，海拔900～2 600 m。

1.3.2 蛇足石杉 Huperzia serrata （Thunb.） Trev. in Atti Soc. Ital. Sci. Nat. 17（2）： 248. 1874. Type： Japan， Thunberg s.n. （holotype， UPS-25333B）.

Lycopodium serratum Thunb. in Syst. Veg. ed. 14： 944. 1784.

莖直立或斜向上生，株高15～25 cm，莖徑1.5～2 mm。頂芽分叉寬處1.5～2 cm，窄處0.5～1 cm。孢子葉和營養(yǎng)葉同形，營養(yǎng)葉密集著生，在莖上呈直角或稍下彎曲;葉披針形，葉片長5～15 mm，近中部最寬處1～2.5 mm;葉片背面中脈不明顯;葉基楔形，下延，有柄;葉邊緣不皺曲，鋸齒狀，葉尖漸尖。

分布：黑龍江、吉林和遼寧。

生境：生于林下，路邊干燥的地方;海拔400～1 000 m。

1.3.3 南嶺石杉 Huperzia nanlingensis Y. H. Yan et N. Shrestha in Phytotaxa 173 （1）：73-79. 2014. Type： China， Guangdong， Ruyuan， Y. H. Yan et al. 1051 （holotype， IBSC; isotype， HUST-870）.

株高20～35 cm，莖粗約3 mm，基部橫臥，上部呈紫色。小枝最寬處4.5～5.5 cm，窄處0.7～0.9 cm。孢子葉和營養(yǎng)葉同形，營養(yǎng)葉著生在莖上呈直角或稍向上斜展，葉片橢圓狀披針形，長20～30 cm，寬3～5 mm，革質(zhì)，光滑，葉片紫紅色;葉片背面中脈不明顯;葉基楔形，具柄;葉邊緣不皺曲，鋸齒狀，葉尖急尖。孢子葉長2～4 mm，寬0.5 mm，在莖上反折，革質(zhì)，綠色，邊緣略有鋸齒，葉尖急尖，葉基楔形，無柄。

分布：貴州、湖南和廣東。

生境：生于林下腐殖質(zhì)豐富的砂土上和陰濕的地面上，海拔1 100～1 400 m。

1.3.4 千層塔? Huperzia javanica（Sw.） C.Y. Yang in Bulletin of the Academy of Milit Med Sci 13（5）： 368. 1989. Type： Indonesia. Java， Thunberg s.n. （holotype， UPS-25320B）

Lycopodium javanicum Sw. in Journal für die Botanik 1800（2）： 114. 1801. Lycopodium serratum var. longipetiolatum Spring in Monogr.Lycop. 2： 18， pl. 1， f. 9-11. 1850. Huperzia serrata var. javanicum Makino in Bot. Mag. 12： 13. 1898. Huperzia serrata f. longipetiolata （Spring） Ching in Acta Bot.Yunnan 3（3）： 294. 1981. Huperzia longipetiolata （Spring） C.Y. Yang in Chin Tradit Herb Drugs 16（7）： 32-33. 1982.

莖直立或斜向上，株高10～30 cm，莖粗1.5～3.5 mm。分枝最寬處2～5 cm，最窄處1～2.5 cm。孢子葉和營養(yǎng)葉同形，營養(yǎng)葉稀疏，在莖上呈直角著生;葉橢圓形或倒闊披針形，中部或中上部最寬，長10～25 mm，寬2～6 mm;葉片背面中脈不明顯;葉片基部明顯狹縮下延，葉基楔形，有柄;葉邊緣不皺曲，具不規(guī)則鋸齒狀，葉尖急尖。孢子葉稀疏，在莖上呈直角著生或稍下彎曲，葉片橢圓形或披針形，長7～15 mm，寬1.5～3.5 mm，中脈不明顯，葉尖急尖，葉基楔形，下延，有柄，柄長1～3.5 mm，邊緣具不規(guī)則鋸齒。

分布：安徽、重慶、福建、廣東、廣西、貴州、海南、湖北、湖南、江蘇、江西、四川、臺灣、西藏、云南和浙江。

生境：生于林下地上和路邊;海拔300～1 200 m。

2 遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，體現(xiàn)了生物的穩(wěn)定性和進化潛力。研究千層塔的遺傳多樣性有助于評估其進化地位，為保護和開發(fā)千層塔資源奠定基礎(chǔ)。

最初，Luo et al. （2010）對千層塔的根、莖和葉進行454-EST測序，共獲得2 729個SSR位點，但并未進行深入探討。張林甦等（2018）對采自貴州的千層塔的根、莖、葉、芽與孢子進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得50 388個SNP位點和11 934條SSR序列，隨后設(shè)計并獲得了12 010對SSR引物，篩選出的SSR長度在150 bp左右，代表中等程度的多態(tài)性。何美娜（2017）對中國五個地區(qū)的千層塔進行了轉(zhuǎn)錄組測序，SSR分析結(jié)果表明千層塔群體間遺傳相似性很高，居群內(nèi)比群體間的遺傳變異高，不同群體間基因流水平也較高，高水平的基因流有利于增加遺傳多樣性，降低居群間分化程度。與之類似，擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分子標(biāo)記（黃驥等，2014）、簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增（ISSR）和目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分子標(biāo)記（Minh et al.， 2019）結(jié)果均表明千層塔野生資源的遺傳多樣性豐富，具有較高的基因流和較強的環(huán)境適應(yīng)能力，因此造成目前野生千層塔資源稀少的主要原因不是其遺傳多樣性的喪失，而更可能是人類活動造成的生境破壞和對千層塔的過度采挖。

3 組學(xué)研究進展

近幾十年來，組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，主要包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)等，對千層塔和蛇足石杉進行的各類組學(xué)研究有助于深入了解石杉堿甲的合成代謝途徑，是尋找替代石杉堿甲源植物生產(chǎn)藥物的新途徑。表1匯總了近年來以千層塔和蛇足石杉為研究對象的組學(xué)研究，研究對象以千層塔居多，研究方法以轉(zhuǎn)錄組學(xué)居多。

3.1 質(zhì)體基因組學(xué)

Guo et al. （2016）首次報道了蛇足石杉（H. serrata）的質(zhì)體基因組大小為154 176 bp，GC含量為36.3%，包含了86個編碼基因，30個tRNA基因和4個rRNA基因（圖7）。Zhang et al. （2017）報道了千層塔（H. javanica）的質(zhì)體基因組結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明千層塔的質(zhì)體基因組大小為154 415 bp，GC含量為36.4%，包含了86個編碼基因，29個tRNA基因和4個rRNA基因，千層塔和蛇足石杉的質(zhì)體基因組在大小、GC含量和tRNA基因數(shù)量上略存在差異。Zhang et al. （2017）利用質(zhì)體基因組建立的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（圖4）也表明，千層塔和蛇足石杉在質(zhì)體基因組上已經(jīng)發(fā)生明顯分化。

3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

千層塔和蛇足石杉轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究始于2010年。Luo et al. （2010）通過對千層塔和同樣富有藥用價值的龍骨馬尾杉（Phlegmariurus carinatus）進行比較轉(zhuǎn)錄組研究，共注釋出千層塔16 274個轉(zhuǎn)錄本和許多可能參與三萜類、生物堿和黃酮/類黃酮合成和生長發(fā)育相關(guān)的基因。Luo et al. （2010）測序并注釋出96個可能在石杉堿甲合成中參與環(huán)化、重排、修飾和氧化的CYP450基因家族，他們選擇其中20個進行了實時PCR分析，結(jié)果顯示CYP450在葉中的表達水平比在根中更高。

何美娜（2017）和Guo et al. （2019）利用Illumina Highseq平臺對千層塔地上部分構(gòu)建了cDNA庫，獲得的111 251個轉(zhuǎn)錄本中有48 989條比對數(shù)據(jù)庫并成功注釋，注釋結(jié)果也顯示千層塔中表達有許多與生物堿合成代謝相關(guān)的基因，他們還通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)了與石杉堿甲合成相關(guān)的通路（賴氨酸合成途徑）和代謝相關(guān)的通路（賴氨酸降解途徑）。Yang et al. （2017） 對千層塔的根、莖、葉、孢子分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，共注釋出105 516個轉(zhuǎn)錄本，是目前為止注釋出轉(zhuǎn)錄本數(shù)量最多的研究，其轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明千層塔中至少存在21個功能通路，并預(yù)測出參與石杉堿甲前體生物合成的LDC、CAO和PKS三種候選酶基因，還預(yù)測出1 478個SSR和2 975個轉(zhuǎn)錄因子基因;之后采用qRT-PCR成功驗證了HsLDC、HsCAO、HsPKS和CYP450s等7個參與石杉堿甲生物合成的基因。

Peng et al. （2020）對千層塔的嫩葉、老葉和莖分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，共注釋出49 923個轉(zhuǎn)錄本，該研究對不同組織之間和相同組織不同重復(fù)間進行了差異表達分析，結(jié)果顯示40 612個轉(zhuǎn)錄本在所有組織中普遍表達，9 311個轉(zhuǎn)錄本在一個或兩個組織中獨特表達。該研究重點關(guān)注了在石杉堿甲合成早期階段起作用的兩個LDC和3個CAO基因，LDC1在老葉中最高，幼葉和莖次之，而LDC2在三種組織中表達量相似;CAO1序列在三種組織中都有發(fā)現(xiàn)，且葉片高于莖，而CAO2序列為嫩葉僅有;CAO3序列只來自于葉片，老葉的表達量高于嫩葉。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)正不斷成熟，加上價格適宜，已成為眾多生物學(xué)家研究千層塔等中藥材的不二之選。伴隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的進步，識別出的轉(zhuǎn)錄本不斷積累和增加，參與石杉堿甲代謝途徑各個階段的基因也逐將分解清晰。結(jié)合表1統(tǒng)計的研究對象分布的地理位置和中國蛇足石杉復(fù)合體分布圖（圖6）可知，可能是由于千層塔的分布地域遼闊，更容易采獲，盡管論文中都使用了蛇足石杉和H. serrata這一學(xué)名，但是轉(zhuǎn)錄組學(xué)的實際研究對象均為千層塔，人們對蛇足石杉（H. serrata）的轉(zhuǎn)錄組研究還不了解。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)

林如輝（2009）對來自三個不同產(chǎn)地的千層塔的蛋白質(zhì)組學(xué)進行研究，共得到15個差異蛋白質(zhì)點。余曉等（2019）對產(chǎn)石杉堿甲能力不同的三個千層塔株系進行串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果顯示含量最低與含量最高的株系之間具有78個差異蛋白，其中參與生物堿代謝途徑的差異蛋白有Q8RXU4和P93541兩種，前者在低含量的株系中表達下調(diào)，后者在高含量的株系中表達下調(diào)。

這些研究為HupA的生物合成途徑和深入探討其中的關(guān)鍵酶系提供了依據(jù)，也體現(xiàn)了不同產(chǎn)地生長的千層塔具有遺傳的多樣性。因此，在開展千層塔的引種、栽培、繁殖等工作時，應(yīng)注意到遺傳背景生態(tài)因子等差異對產(chǎn)量帶來的影響。

3.4 代謝組學(xué)

由于石杉堿甲的特殊功效，代謝組學(xué)最初的研究重點在石杉堿甲，因此多為靶向代謝組學(xué)（Ma et al.， 2005; Cuthbertson et al.， 2012）。隨著技術(shù)的發(fā)展與研究范圍的擴大，Ishiuchi et al. （2013）基于超高效液相色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）的代謝組學(xué)方法鑒定出27種石松生物堿。Wu et al. （2018）利用一種UPLC-MS相對定量的代謝組學(xué)方法，對千層塔葉、莖、根不同組織進行了綜合代謝組學(xué)分析，借助一種新型計算工具最終鑒定出118種可能的化學(xué)物質(zhì)，還發(fā)現(xiàn)了兩種區(qū)分不同組織的代謝標(biāo)志物Peak4388和Peak3954。

許多石松生物堿具有相同的分子式和分子骨架，相似的質(zhì)譜和色譜譜圖，這成為鑒定石松生物堿和研究石杉代謝組學(xué)的一大障礙。未來有望研發(fā)出更精準(zhǔn)的識別工具和鑒定方法，實現(xiàn)石松生物堿的精準(zhǔn)鑒定。

4 內(nèi)生真菌

內(nèi)生真菌是指存在于宿主植物生活史的某個或整個階段的組織內(nèi)或者細胞間隙中，而不會導(dǎo)致宿主出現(xiàn)明顯病害癥狀的真菌（Wilson，1995）。內(nèi)生真菌可產(chǎn)生多種對宿主有益并具有藥理活性的次生代謝產(chǎn)物（郭龍妹等，2019），有些內(nèi)生真菌還能產(chǎn)生與宿主相似或者相同的代謝產(chǎn)物（任靜，2020）。自1993年從短葉紅豆杉（Taxus breviflia）分離出一株能夠和宿主一樣產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌（Taxomyces andreanae）以來，利用內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)進行天然化合物的生物合成逐漸成為研究熱點（Stierle et al.， 1993）。

野生千層塔和蛇足石杉含有大量的內(nèi)生真菌，其中，莖和葉中內(nèi)生真菌數(shù)量遠多于根內(nèi)（張琳等，2010;汪涯等，2011）。近年來，這些內(nèi)生真菌產(chǎn)石杉堿甲的潛力已被研究者發(fā)現(xiàn)和重視，有關(guān)千層塔內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究也逐年增多。張鑫（2018）總結(jié)往年文獻，匯總出經(jīng)ITS序列和《真菌鑒定手冊》鑒定的內(nèi)生真菌249株，其中產(chǎn)石杉堿甲的真菌有32株，19株已檢測出石杉堿甲產(chǎn)率。

千層塔和蛇足石杉近緣種屬植物內(nèi)生真菌的研究也取得了一些進展。針對皺邊石杉內(nèi)生真菌的一些研究發(fā)現(xiàn)，其中一些內(nèi)生真菌也具有生產(chǎn)石杉堿甲的潛力（禹利君，2007;史云峰，2012;胥錦樺，2012）。小杉蘭的配子體和孢子體中同樣存在許多內(nèi)生真菌，其物種多樣性和物種豐富度與環(huán)境有關(guān)，尤其是和海拔呈正相關(guān)（Budziszewska & SzypuA， 2010）。

盡管更多能夠生產(chǎn)石杉堿甲的千層塔和蛇足石杉內(nèi)生真菌正不斷被鑒定分離出來，但是由于菌種退化和產(chǎn)量甚微等問題，距離滿足臨床需求和實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還存在很大距離（Zhang et al.， 2011）。利用生物合成生產(chǎn)石杉堿甲的方法新型、高效又環(huán)保（Chen et al.， 2014），具有重要的開發(fā)價值和潛力。隨著相關(guān)研究的不斷深入，相信實現(xiàn)石杉堿甲的工廠化生產(chǎn)為期不遠。

5 化學(xué)成分

各種分離方法已應(yīng)用于分離檢測千層塔的化學(xué)成分，如薄層反復(fù)硅膠柱層析、RP-18反相硅膠、薄層硅膠層析板、Sephadex LH-20凝膠柱等，分離出的主要成分有生物堿、黃酮類、三萜類、多糖、有機酸、蒽醌等（李關(guān)艷，2017）。截至2017年，從千層塔及其親緣物種中分離出的生物堿已有300多種（王義坤等，2017），但除了石杉堿甲，其他生物堿鮮有乙酰膽堿酯酶抑制能力，有抑制能力的生物堿的生物活性也大都低于石杉堿甲（譚昌恒和朱大元，2003）。

石杉堿甲作為千層塔的重要化學(xué)成分，已有研究報道了它可能的生物合成途徑（謝峻等，2020）。但是具體的生物合成途徑，特別是下游的具體步驟仍不清楚，想要通過人工合成獲得石杉堿甲仍存在挑戰(zhàn)。因此，尋找更優(yōu)的石杉堿甲源植物也備受關(guān)注。

已有大量研究報道了石杉堿甲在千層塔及其近緣類群的不同部位、不同成長階段、不同居群中的含量差異性（邵浩等，2009;杜次等，2013;溫慧敏等，2014）。目前，對我國湖南和浙江的千層塔個體或居群進行的石杉堿甲含量測定最多，其次為貴州、湖北和福建等地，而西南地區(qū)最少（圖6）。植株不同部位的石杉堿甲含量通常是根<葉≈莖，葉和莖的石杉堿甲含量最高為根的10倍（孫遠明等，2002;顧月華和吳慶慶，2005;郭水良等，2006;邵浩等，2009;王峻和潘勝利，2009;鄭雅媗等，2013;杜次等，2013;張方方等，2015）。除石杉屬植物能產(chǎn)石杉堿甲（Ma & Gang， 2008;王峻和潘勝利等，2009）外，石松科其他植物，如石杉屬的伏帖石杉（H. adpressa）（王峻和潘勝利，2009）、馬尾杉屬的喜馬拉雅馬尾杉（Plegmariurus hamiltonii）（郭水良等，2006）和柳杉葉馬尾杉（P. cryptomerinus）等也含石杉堿甲（王峻等，2003;王峻和潘勝利， 2009;趙惠等，2018），含量為0.15%～0.20%。

6 繁殖技術(shù)

野生石杉屬植物植株生長十分緩慢（齊耀東和王德立，2017），且千層塔和蛇足石杉的生長發(fā)育和微乎其微的石杉堿甲含量還易受環(huán)境因素的影響（王志安等，2008;石瑋等，2008）。為了在滿足藥物生產(chǎn)需求的同時保護石杉資源，建立合適的人工繁殖體系刻不容緩。

6.1 扦插繁殖

扦插繁殖受到植物本身的生物學(xué)特性、插條的發(fā)育程度和長度、生長調(diào)節(jié)劑和環(huán)境等因素的影響?，F(xiàn)已證明能促進千層塔扦插成活的激素有吲哚丁酸（IBA）（盛束軍等，2000）和蕓苔素內(nèi)酯（BR）（馮世鑫等，2010），而萘乙酸（NAA）（盛束軍等，2000）和赤霉素（GA）（曾漢元和張伍佰，2008）效果甚微，甚至?xí)霈F(xiàn)抑制現(xiàn)象。莖尖似乎是插條不可或缺的部位，不帶莖尖的扦插植株無一存活（龍華等，2014）。在培養(yǎng)基質(zhì)方面，混合土壤比單一土壤更適合千層塔扦插（盛束軍等，2000;馮世鑫等，2010）。土壤中的微生物、內(nèi)生真菌和外共生真菌也影響著扦插的效果（李娜等，2007，2008;駱冰潔，2016）。

6.2 珠芽繁殖

珠芽繁殖雖然在數(shù)量上不及孢子繁殖，但是珠芽繁殖的萌發(fā)和生長速度快，培育簡單。珠芽繁殖出的一年生苗高約為2.2 cm，兩年生苗高約6.0 cm（曾漢元和張伍佰，2008）。珠芽喜弱光，萌發(fā)的最適宜溫度是（22±2） ℃。外源激素似乎并不促進珠芽萌發(fā)，GA3、NAA和IAA對珠芽萌發(fā)都具有一定的抑制作用（駱冰潔，2016）。

6.3 組織培養(yǎng)

組織培養(yǎng)過程中可能存在的微生物和千層塔本身莖段皮層中共生的內(nèi)生真菌使得外植體的消毒成為千層塔組織培養(yǎng)的首要難題（劉建成等，2019）。研究表明，先對野生植株進行室內(nèi)水培或土培，再取莖尖進行組培能大大降低染菌率，成活率在70%以上（沈曉霞等，2002）。采用側(cè)芽、莖尖、幼根與孢子等均能誘導(dǎo)愈傷組織，但千層塔愈傷組織誘導(dǎo)率并不高（周穎等，2009;包日雙等，2012）。還可采用淺層液體培養(yǎng)千層塔葉狀體，效果比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)更好（袁慧慧等，2019）。

6.4 引種栽培和人工馴化

引種栽培和人工馴化也是生產(chǎn)植物中藥材常用的方法。選擇合適的土壤，且在較高蔭蔽度和濕度的環(huán)境下能提升人工栽培成活率（林如輝，2009）。不同基質(zhì)對移栽也有影響，水苔的移栽成活率最高，腐殖質(zhì)土壤次之（包日雙，2013），堿性土壤不適合千層塔遷移苗，應(yīng)注意選用弱酸性土壤（曾漢元和張伍佰，2008）。在新品種選育上，閆志剛等（2012，2014）通過3 a的淘汰選擇，成功育成高產(chǎn)新品種“容杉1號”“容杉2號”。

由于千層塔和蛇足石杉本身生長緩慢，繁殖能力弱，生長需要一定海拔和蔭濕環(huán)境，很難進行人工快速繁育，大量的人工繁殖和栽培目前還沒有成功，因此藥材收購仍然依賴于野生植物資源。盡管已有不少高產(chǎn)新品種培育出來，但是中高產(chǎn)品種的應(yīng)用與培育同樣重要。如何縮小培育成本，實現(xiàn)資源藥用植物的批量生產(chǎn)是一大難題，仍需投入更多努力。

7 資源現(xiàn)狀

吳葒等（2005）結(jié)合野外采樣與當(dāng)時的標(biāo)本和文獻資料對全國千層塔和蛇足石杉資源進行調(diào)查和評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分布面積為260×104? km2，天然產(chǎn)物量為4 656.6 t，結(jié)合實際后的理論采樣量為1 604 t;該研究還指出，盡管千層塔和蛇足石杉分布很廣，但是它植株矮小，呈零星散生狀分布，多生長在自然保護區(qū)內(nèi)和風(fēng)景區(qū)，且更新周期長，不支持大規(guī)模開采。馬小軍等（2009）對廣西千層塔主要分布區(qū)的調(diào)查結(jié)果也支持這一點。此外，一些千層塔種群正在衰退，在自然保護的情況下種群的生存狀況仍然嚴峻（潘麗梅等，2015）。黃驥等（2011）對武陵山區(qū)千層塔居群進行了較全面的研究，表明千層塔在草本層較單一，且種間競爭較弱的生境中，常能形成小片優(yōu)勢，而在物種組成繁雜、種間競爭較大的群落中，僅零星分布，這種對特定生態(tài)位的選擇，使其在分布上呈現(xiàn)居群間相互隔離，居群內(nèi)因生境異質(zhì)化而造成片斷化分布的特點。齊耀東和王德立（2017）調(diào)查江西、貴州、廣西、重慶及海南的千層塔天然種群發(fā)現(xiàn)這些調(diào)查樣地的居群結(jié)構(gòu)相似，幼苗和幼株為居群的主要構(gòu)成，成株相對較少。這些地區(qū)的資源破壞嚴重，特別是貴州樣地有可能出現(xiàn)物種瀕危情況，實地資源調(diào)查顯示重慶和四川的一些地區(qū)的千層塔即將或已經(jīng)滅絕，可能是原始林減少、生境干旱、農(nóng)事影響、人為采集等造成的（王德立等，2011）。

總的來說，由于千層塔生長緩慢、分布零散，本就不適合大規(guī)模開采，全球溫度變化、城市化等也正對千層塔帶來不利影響，但作為近幾十年來引起人們廣泛關(guān)注的阿爾茨海默病藥用植物，野生千層塔資源正遭受著大量人為采集，生境被肆意破壞。為了保護藥用資源可持續(xù)發(fā)展，保護生物多樣性，亟待加強對千層塔野生資源的保護。

8 展望

千層塔自古以來就是一味珍稀的中草藥，具有退熱、止血、消腫散毒等功效。隨著千層塔的有效成分石杉堿甲治療阿爾茨海默病的功效廣為人知，近40年來千層塔野生植物資源被人們大量采挖，造成極度的資源短缺。本文考證地理、形態(tài)、名實出處等各個方面，澄清了一直以來人們認為蛇足石杉（H. serrata）就是千層塔的誤解，指出藥用千層塔實際是指產(chǎn)自我國南部的H. javanica，模式標(biāo)本采自印度爪哇。本文從系統(tǒng)與分類學(xué)、遺傳多樣性、組學(xué)研究、內(nèi)生真菌、化學(xué)成分、資源調(diào)查、栽培繁殖和資源保護等各個方面綜述了近年來有關(guān)千層塔的研究，總結(jié)和思考未來千層塔的研究方向，我們堅信對千層塔的研究勢必能為治療阿爾茨海默病帶來突破性進展。

伴隨著世界人口老齡化的趨勢，越來越多老年人罹患阿爾茨海默病。據(jù)WHO統(tǒng)計，截至2015年全球阿爾茨海默病患者約有2 980萬人，預(yù)計2030年將增長到6 600萬人，2050年預(yù)計高達1.15億（Reitz & Mayeux， 2014; Mancuso & Santangelo，2018）。與此同時，青少年對益智產(chǎn)品的需求也不斷增長。在眾多阿爾茨海默病治療藥物以及益智產(chǎn)品中，石杉堿甲以其作用時效長、副作用少而獲得大眾青睞。在自然界中，石杉屬植物生長需要一定的海拔、光照和蔭濕環(huán)境，自然界中很難依靠孢子快速繁殖，也很難通過組織培養(yǎng)批量生產(chǎn)。石杉堿甲的化學(xué)合成雖已實現(xiàn)，但成本還是太高，難以滿足市場實際需求;現(xiàn)在市面上生產(chǎn)石杉堿甲還是依靠大規(guī)模采集野生資源，這導(dǎo)致石杉屬植物原始生境被破壞，種群數(shù)量急劇下降。不只是千層塔，含石杉堿甲的其他石杉屬和馬尾杉屬植物資源都已被過度開采，亟待對這兩個屬的植物開展人工栽培和繁殖研究，建議將馬尾杉屬和石杉屬的全部物種列入國家重點保護植物名錄，以加強對野生藥物資源的有效保護和可持續(xù)性利用。

為了走出這一困境，科學(xué)工作者已從多個方面做出努力，并取得了一定成果。首先是建立快速繁殖體系擴大生產(chǎn)，主要包括孢子繁衍、扦插繁殖、分株繁殖、芽孢繁殖和組織培養(yǎng)等方法。但是千層塔的有性繁殖非常困難，孢子發(fā)育周期漫長，孢子繁育難度很大，仍需深入開展基礎(chǔ)理論研究來探索孢子的最佳破壁方式和最佳萌發(fā)條件;而扦插繁殖和分株繁殖的繁殖系數(shù)低;珠芽繁殖雖然萌發(fā)率和成活率高，但是珠芽的數(shù)量稀少，生成條件苛刻，也是接下來需要攻克的壁壘;組織培養(yǎng)則依賴無菌環(huán)境，耗時耗力，目前誘導(dǎo)率也不高，這些研究都沒有實現(xiàn)千層塔的大批量生產(chǎn)。目前，石杉堿甲的化學(xué)合成成本仍然太高，而內(nèi)生真菌生產(chǎn)石杉堿甲的周期短、成本低、易培養(yǎng)，具有極大的研究潛力和應(yīng)用前景，今后可從內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)及合成生物學(xué)方面開展深入的研究，提出石杉堿甲生物合成的創(chuàng)新方法。還可通過基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等組學(xué)方法和分子生物學(xué)對石杉堿甲合成通路進行完整剖析，運用生物技術(shù)驗證基因的表達和酶的作用原理，或結(jié)合組培技術(shù)和內(nèi)生真菌發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)石杉堿甲，或從分子水平對千層塔進行品質(zhì)改良。不管是哪種繁殖方法，都需要強大的種質(zhì)基礎(chǔ)，但目前對于蛇足石杉復(fù)合體的物種分類和劃分還不統(tǒng)一，有必要進一步在全國范圍內(nèi)廣泛開展石杉屬資源調(diào)研，尋找最具潛力的種質(zhì)資源。

千層塔的深入研究、開發(fā)利用和資源保護之路任重道遠。千層塔的研究突破是廣大阿爾茨海默病患者的福音，也是老齡化逐漸加劇的社會的福音。

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（責(zé)任編輯 何永艷）