付春 唐雪 楊瑤君 江納

摘 要：? WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中不可缺少的部分，作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物的多種應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。該文利用生物信息學(xué)方法對(duì)中粒咖啡WRKY蛋白家族的理化特性及其分子進(jìn)化進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果表明：（1）CcWRKY蛋白氨基酸數(shù)量在103～994個(gè)之間，均無(wú)信號(hào)肽，推測(cè)其為非分泌性蛋白;其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為最主要的結(jié)構(gòu)元件，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要分為6類，其中以CcWRKY15、CcWRKY25、CcWRKY37和CcWRKY42為主要成員的D類結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。（2）保守結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，中粒咖啡WRKY基因家族含有49個(gè)成員，其中的10個(gè)成員歸為WRKY第Ⅰ家族，34個(gè)成員歸為WRKY第Ⅱ家族，5個(gè)成員歸為WRKY第Ⅲ家族。（3）中粒咖啡 WRKY47基因與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，WRKY47與煙草親緣關(guān)系最近，與非洲油棕（Elaeis guineensis）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說(shuō)明WRKY47蛋白在生物進(jìn)化過(guò)程中比較保守。該研究結(jié)果可為中?？Х萕RKY基因家族分子功能的深層次研究提供一定的借鑒作用，對(duì)進(jìn)一步探究中?？Х萕RKY基因的功能、進(jìn)化以及分子育種具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 中?？Х?， WRKY， 轉(zhuǎn)錄因子， 系統(tǒng)進(jìn)化， 生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：? Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2021）11-1905-15

Bioinformatics analysis of WRKY gene family in Coffea canephora

FU Chun1，2*， TANG Xue1，2， YANG Yaojun1，2， JIANG Na 3

（ 1. Bamboo Disease and Pests Control and Resources Development Key Laboratory of Sichuan Province， Leshan Normal University， Leshan

614000， Sichuan， China; 2. College of Life Science， Leshan Normal University， Leshan 614000， Sichuan， China; 3. College of Mathematics and Information Science， Leshan Normal University， Leshan 614000， Sichuan， China ）

Abstract：? WRKY transcription factor is an indispensable part of plant signal network. As one of the largest family of transcription factors in plants， WRKY transcription factor plays an important role in various stress responses of plants. The physicochemical properties and molecular evolution of WRKY protein family of Coffea canephora were analyzed in detail by bioinformatics methods. The results were as follows： （1） The amino acids numbers of WRKY proteins were from 103 to 994， and there was no signal peptide， and were presumed to be a non-secretory protein. Random coil was the most important structural element in the secondary structure of its WRKY proteins. The tertiary structure of WRKY proteins were mainly divided into six categories， among which the D-class structure with CcWRKY15、CcWRKY25、CcWRKY37 and CcWRKY42 as the main members was the most stable. （2） Conserved domain and phylogenetic tree analysis indicated that the WRKY gene family in C. canephora contained 49 members， 10 of which were classified as WRKY class I， 34 members were classified as WRKY class Ⅱ， and 5 members were classified as WRKY class Ⅲ. （3） The phylogenetic analysis of WRKY47 gene of C. canephora and other species showed that WRKY47 of C. canephora was the most closely related to tobacco and the most distant to Elaeis guineensis， indicating that WRKY47 protein is relatively conservative in the process of biological evolution. The results of this study can provide some reference for the further study of the molecular function of WRKY gene family of C. canephora， and have important practical significance for further exploration of the function， evolution and molecular breeding of WRKY gene in C. canephora.

Key words： Coffea canephora， WRKY， transcription factor， phylogenetic evolution， bioinformatics

中?？Х龋–offea canephora）的年平均產(chǎn)量和產(chǎn)值均居三大飲料作物之首，其消費(fèi)量也位居第一（閆林等，2018）。它作為一種重要的提神飲料已有成百上千年的歷史，是國(guó)際貿(mào)易中非常重要的原料產(chǎn)品（Monente et al.， 2015）。中?？Х仁菍儆谲绮菘瓶Х葘俚囊环N小喬木或灌木，咖啡屬植物共100多種，而生產(chǎn)性栽培的主要為小粒種和中粒種，分別占世界咖啡產(chǎn)量的60%和40%。2014年，海南以種植中粒種咖啡為主，咖啡種植面積占全國(guó)的0.47% （Rodrigues et al.， 2015; 閆林等，2018）。雖然中粒種咖啡理想的種植環(huán)境是在氣溫高、降雨量豐沛的地方，但在栽培過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遭遇病害、干旱和低溫等脅迫，嚴(yán)重影響了其生長(zhǎng)發(fā)育，從而給生產(chǎn)帶來(lái)重大損失（楊華庚，2014）。

植物中WRKY蛋白是一種普遍存在的基因超家族轉(zhuǎn)錄因子，是植物科學(xué)研究中最多的一種轉(zhuǎn)錄因子，歸屬于高等植物的10大超家族轉(zhuǎn)錄因子（鄭超等，2018）。WRKY因其家族所有成員的N端均含有由WRKYGQK 7個(gè)氨基酸組成的保守序列而得名，依據(jù)其特點(diǎn)將植物中的WRKY基因超家族（李智等，2019）劃分為3個(gè)家族，即I、Ⅱ、Ⅲ家族（鄭超等，2018）。I家族具有2個(gè)WRKY域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H） （其中X可以表示任一氨基酸）;Ⅱ家族由1個(gè)WRKY域和1個(gè)以C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）為代表的鋅指結(jié)構(gòu)域組成;Ⅲ家族由1個(gè)WRKY域和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)（C-X7-C-X23-H-X1-C）組成（Bakshi et al.， 2014）。Ishiguro & Nakamura（1994）首次在甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出首個(gè)WRKY基因并鑒定了1個(gè)DNA binding蛋白，命名為SPF1轉(zhuǎn)錄因子。隨后，在不同作物中克隆和鑒定到大量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，包括蓖麻（56個(gè)WRKY基因）（鄒智，2013）、獼猴桃（89個(gè)WRKY基因）（包昌艷等，2018）、番茄（81個(gè)WRKY基因）（張紅，2017）、葡萄（56個(gè)WRKY基因）（蘇玲等，2019）和棗（92個(gè)WRKY基因）（薛寶平等，2018）等。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物種子解除休眠、代謝和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等調(diào)控（謝政文等，2016），在很多植物的發(fā)育和生理過(guò)程中具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的功能（Rushton et al.， 2012; Ding et al.， 2015）。有研究分析指出，WRKY基因家族在鹽脅迫、高溫、低溫和干旱等應(yīng)答非生物脅迫條件下起到了非常重要的作用（Wu et al.， 2009; 李曉穎等，2019）。也有研究報(bào)道，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，如果實(shí)成熟（Xu et al.， 2004）、胚胎發(fā)育（Lagacé et al.， 2004）和衰老（Robatzek et al.， 2010; 張柳等，2019）等。包昌艷等（2018）發(fā)現(xiàn)在獼猴桃中有33個(gè)WRKY基因在植物根、葉、花和果4個(gè)器官中均有顯著性表達(dá);張柳等（2019）在蘋果WRKY基因家族研究中發(fā)現(xiàn)有12個(gè)MdWRKY均在根、莖、葉、花和果中表達(dá)，表明MdWRKY可能參與調(diào)控蘋果生長(zhǎng)和發(fā)育等過(guò)程;谷彥冰等（2015）在煙草‘云煙87’葉片衰老WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究中指出，NtWRKY11、NtWRKY31、NtWRKY40和NtWRKY51與逆境脅迫相關(guān)，且在葉片衰老中起到交叉作用。到目前為止，在中?？Х绒D(zhuǎn)錄因子中，雖然對(duì)TPS基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)分析（程甜等，2016），但對(duì)WRKY基因家族研究甚少。Dong et al.（2019）對(duì)中粒咖啡全基因組鑒定了49個(gè)CcWRKYs，并研究了其對(duì)寒冷脅迫的響應(yīng)。本研究將通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)中?？Х萕RKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守基序、蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析以及與煙草、獼猴桃、水稻等物種的親緣關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為進(jìn)一步研究與生物逆境相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（版本為V5.0）（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php）獲取中?？Х龋–offea canephora）、水稻（Oryza sativa subsp. indica）、玉米（Zea mays）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、煙草（Nicotiana tabacum）、板栗（Castanea mollissima）、非洲油棕（Elaeis guineensis）、小果野蕉（Musa acuminata）、毛竹（Phyllostachys heterocycla）、棗（Ziziphus jujuba）、蘋果（Malus domestica）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）12個(gè)物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的核苷酸序列及氨基酸序列。通過(guò)Blastp程序比對(duì)擬南芥WRKY蛋白序列找出中?？Х绒D(zhuǎn)錄因子WRKY（CcWRKY）基因家族成員的對(duì)應(yīng)關(guān)系（表1）。

1.2 方法

1.2.1 WRKY家族成員編碼蛋白理化性質(zhì)分析 運(yùn)用PrtoParam在線程序分析了CcWRKY蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸長(zhǎng)度、總平均親疏水性及帶正負(fù)電荷氨基酸數(shù)量等指標(biāo)的相關(guān)預(yù)測(cè)。利用在線軟件SignalP-5.0和CELLO v2.5（Yu et al.， 2006; 沙桐等，2019）分別對(duì)49條中?？Х萕RKY基因家族的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位分析。

1.2.2 氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)、親疏水性、磷酸化位點(diǎn)及保守基序預(yù)測(cè) 在TMHMM Server v.2.0在線軟件中（周潔和黃婧，2018）輸入中?？Х萕RKY蛋白序列，分析該蛋白家族的跨膜結(jié)構(gòu)。通過(guò)Protscale在線網(wǎng)站完成其親疏水性預(yù)測(cè)分析。通過(guò)NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對(duì)中?？Х萕RKY蛋白序列潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用MEME 5.0.4在線工具搜索中?？Х萕RKY基因家族成員的Motif，參數(shù)設(shè)置為保守基序個(gè)數(shù)為10，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

1.2.3 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析了中?？Х?9種WRKY蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（張春蘭等，2018）。利用Phyre 2（Kelley et al.， 2015）網(wǎng)站對(duì)49種WRKY蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.4 中粒咖啡WRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用MEGA 7.0軟件（王鵬洋等，2019）對(duì)CcWRKY蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)中粒咖啡、擬南芥、煙草、獼猴桃、板栗、蘋果和玉米等12個(gè)物種的WRKY1蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Kumar et al.， 2018），對(duì)生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行校正，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次，得到最終的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 中?？Х萕RKY蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化特性

運(yùn)用在線程序PrtoParam（沙桐等，2019）搜索出中?？Х绒D(zhuǎn)錄因子WRKY基因家族共49個(gè)成員，將這些成員的蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行匯總及分析，結(jié)果顯示中?？Х萕RKY基因家族蛋白的氨基酸總數(shù)在103～994個(gè)之間，氨基酸平均為376個(gè);多數(shù)為酸性蛋白質(zhì)，只有19個(gè)成員的理論等電點(diǎn)大于8.0;不穩(wěn)定系數(shù)顯示Cc02_g05280和Cc10_g06400為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)小于40的為穩(wěn)定蛋白）。有3個(gè)成員的帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)等于帶正電荷的殘基總數(shù)，分別是Cc01_g14950和Cc07_g03120，顯示電中性;有25個(gè)成員的帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)大于帶正電荷的殘基總數(shù)，顯示帶負(fù)電荷;有21個(gè)成員帶正電荷的殘基總數(shù)大于帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)，顯示帶正電荷（表1）。

根據(jù)這些成員的氨基酸組成進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示有44個(gè)成員含量最高的氨基酸為絲氨酸，含量在7.5%～16.6%之間（圖1：a，b，c）。其中，有2個(gè)成員（Cc02_g38600和Cc03_g00670）含量最高的氨基酸為脯氨酸（圖1：d，e），1個(gè)成員（Cc05_g04000）含量最高的氨基酸為天冬酰胺（圖1：f），1個(gè)成員（Cc09_g01430）含量最高的氨基酸為丙氨酸（圖1：g），1個(gè)成員（Cc10_g06400）含量最高的氨基酸為賴氨酸（圖1：h）。

2.2 氨基酸的親疏水性預(yù)測(cè)

借助在線工具Protscale對(duì)該蛋白進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)分析，從總體分布來(lái)看，這些轉(zhuǎn)錄因子氨基酸的分值均為負(fù)值，表明它們都是親水性蛋白。由此看出49種WRKY的平均疏水系數(shù)介于-1.196～-0.473之間，表明其都是親水性蛋白。最大疏水性數(shù)值范圍在0.589～2.789之間，最大的是Cc07_g03730成員，最小的是Cc08_g11060成員;最小疏水性數(shù)值范圍在-3.967～-2.511之間，最大的是Cc02_g05280成員，最小的是Cc06_g03470和Cc08_g15270成員。其中，Cc08_g11060的平均疏水系數(shù)最小，說(shuō)明其親水性最強(qiáng)，它的最大疏水性位置是第170個(gè)，值為0.589，最小疏水性位置是第104個(gè)，值為-3.811（表2）。

2.3 信號(hào)肽預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位結(jié)果

這49個(gè)WRKY蛋白均無(wú)信號(hào)肽，推測(cè)其為非分泌性蛋白。分別對(duì)49種WRKY蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，這些家族成員的亞細(xì)胞定位，都位于細(xì)胞核（表1），說(shuō)明CcWRKY家族成員蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。

2.4 編碼氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)分析

采用TMHMM Server v.2.0在線程序（鄭超等，2018）分析中?？Х萕RKY蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示W(wǎng)RKY中僅1個(gè)成員Cc02_g22190蛋白質(zhì)序列的第536個(gè)到第553個(gè)氨基酸之間有1個(gè)明顯跨膜區(qū)域（圖2），其余的48個(gè)成員都無(wú)跨膜區(qū)域，推斷中粒咖啡WRKY不屬于跨膜蛋白。

2.5 磷酸化位點(diǎn)分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，這49種WRKY蛋白中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)量最多，其次是蘇氨酸和酪氨酸。最有可能是潛在磷酸化位點(diǎn)的氨基酸是絲氨酸，其最小值達(dá)0.849，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值0.5。這說(shuō)明CcWRKY基因家族蛋白可能通過(guò)相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能的調(diào)控。其中，Cc07_g03730成員的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)量最多，分別有83個(gè)、39個(gè)和12個(gè)（表3）。

2.6 編碼蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是指蛋白質(zhì)的多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，從CcWRKY家族成員的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以看出，CcWRKY基因家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈組成，這4種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件通常為主要研究對(duì)象（張春蘭等，2018），通過(guò)預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)分析更易了解蛋白的空間結(jié)構(gòu)。其中，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較高，介于45.73%～77.26%之間，其主要功能為連接其他二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，β-轉(zhuǎn)角在二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比均較小。CcWRKY基因家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)較整齊，除Cc00_g06830、Cc05_g14660、Cc07_g16400、Cc08_g11060和Cc10_g06400是無(wú)規(guī)則卷曲>延伸鏈>α-螺旋>β-轉(zhuǎn)角外，其余基因家族成員均是無(wú)規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角（表4，圖3）。

從圖4分析發(fā)現(xiàn)，中粒咖啡WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)可以分為6類，分別以A、B、C、D、E和F表示。其中，D類成員最多，有25個(gè);其次是A類，有9個(gè)成員;E類含有7個(gè)成員，B類含有4個(gè)成員，C類含有3個(gè)成員;最少的是F類，只有1個(gè)成員。從三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來(lái)看，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定從強(qiáng)到弱的順序?yàn)镕>D、E>A>C>B。其中，Cc07_g03730以c5yvfD結(jié)構(gòu)為模板，有315個(gè)氨基酸殘基與模板達(dá)到100%的可信度;Cc05_g08580以c2aydA結(jié)構(gòu)為模板，有75個(gè)氨基酸殘基與模板達(dá)到100%的可信度。

2.7 氨基酸序列的保守基序分析

借助MEME在線工具搜索中?？Х萕RKY基因家族成員的Motif，根據(jù)其保守性的強(qiáng)弱，依次命名為Motif1-Motif6。從序列l(wèi)ogo可以看出，WRKYGQK七肽序列的基序分別存在于Motif1和Motif5中，WRKY基因家族49個(gè)成員均具有Motif1和Motif2，推測(cè)Motif1是WRKY結(jié)構(gòu)域。每個(gè)成員至少都含有1個(gè)WRKY七肽，其中最多的有5個(gè)保守基序，最少的有2個(gè)保守基序。有19個(gè)成員只有Motif1和Motif2;有7個(gè)成員含有Motif1、Motif2、Motif4、Motif5和Motif6（圖5，表5）。

2.8 中?？Х萕RKY蛋白的分子進(jìn)化分析

對(duì)WRKY基因家族成員蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，將下載的49個(gè)家族成員蛋白序列輸入MEGA，并繪制出中粒咖啡WRKY蛋白的進(jìn)化樹（圖6）。從進(jìn)化樹的聚類結(jié)果可以清晰地看出，這49個(gè)成員分成了6組（依次稱為Group 1、Group 2、Group 3、Group 4、Group 5和Group 6）。其中，Group 1成員最多[14個(gè)，CcWRKY09，CcWRKY11，CcWRKY13，CcWRKY18，CcWRKY24，CcWRKY28，CcWRKY29，CcWRKY33，CcWRKY35，CcWRKY40，CcWRKY41， CcWRKY43，CcWRKY44和CcWRKY46]，約占總數(shù)的28.4%;其次是Group 2? [10個(gè)， CcWRKY01，CcWRKY19，CcWRKY20，CcWRKY22，CcWRKY23，CcWRKY26，CcWRKY38，CcWRKY45，CcWRKY47和CcWRKY48]、Group 5? [10個(gè)， CcWRKY02，CcWRKY04，CcWRKY07，CcWRKY10，CcWRKY17，CcWRKY27，CcWRKY30，CcWRKY34，CcWRKY39和CcWRKY42]和Group 3? [9個(gè)， CcWRKY08，CcWRKY14，CcWRKY15，CcWRKY16，CcWRKY25，CcWRKY31，CcWRKY32，CcWRKY37和CcWRKY49];剩余2組成員均較少，Group 6有5個(gè) [CcWRKY3，CcWRKY5，CcWRKY6，CcWRKY12和CcWRKY36]，Group 4僅有1個(gè)（CcWRKY21） （表1）。從進(jìn)化樹分支關(guān)系可以得出，Group 1、Group 2、Group 3、Group 4和Group 5聚類為一大組，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系較近，而Group 6與它們的關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，推測(cè)Group 6成員可能是在物種長(zhǎng)期遺傳進(jìn)化過(guò)程中非常保守，且與祖先關(guān)系最相似的一類而被保留下來(lái)的。

分析進(jìn)化樹分組結(jié)果后，采取家族成員分組比對(duì)的方法，發(fā)現(xiàn)每組的保守氨基酸呈現(xiàn)多樣性。值得注意的是所有組都具有WRKY保守基序，參考Eulgem et al.（2000）分類標(biāo)準(zhǔn)，將得到的49個(gè)WRKY基因家族成員分為3類：Group 2 （D731-H785、D943-H998）屬于WRKY第Ⅰ家族，含有2個(gè)保守的七肽結(jié)構(gòu)（WRKYGQK）和2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)（C2H2型）;Group 6 （D151-C209）屬于WRKY第Ⅲ家族，含有1個(gè)保守的七肽結(jié)構(gòu)（WRKYGQK）和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)（C2HC型）（巴德仁貴等，2017）;Group 1 （D205-H260）、Group 3 （D359-H415）、Group 4 （D151-H206）、Group 5 （D218-H274或P316-H374）含有1個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指型結(jié)構(gòu)域，被歸為WRKY第Ⅱ家族（圖7）。

2.9 中?？Х绒D(zhuǎn)錄因子WRKY與其他物種間的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹結(jié)果顯示，中粒咖啡與11個(gè)物種的WRKY47轉(zhuǎn)錄因子家族成員可分為2個(gè)分支，即煙草、中?？Х?、獼猴桃、擬南芥、板栗、棗和蘋果在第1個(gè)分支，而玉米、水稻、毛竹、小果野蕉、非洲油棕在第2個(gè)分支。在第1個(gè)分支內(nèi)，中?？Х萕RKY47與煙草親緣關(guān)系最近，序列同源性最高，其次與獼猴桃親緣關(guān)系較近，與非洲油棕親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從雙子葉角度來(lái)看，中?？Х扰c獼猴桃、煙草、擬南芥、板栗、棗和蘋果這些植物聚類在一大類，符合雙子葉分類標(biāo)準(zhǔn)，而單子葉玉米、水稻、毛竹、小果野蕉和非洲油棕聚類在另一大類，表明雙子葉和單子葉植物遺傳進(jìn)化具有很明顯的分界線。從喬本類植物的角度來(lái)看，中?？Х萕RKY47與獼猴桃的親緣關(guān)系最近，與非洲油棕關(guān)系最遠(yuǎn);從草本類植物來(lái)看，中?？Х萕RKY47與煙草的親緣關(guān)系最近，與水稻關(guān)系最遠(yuǎn)（圖8）。

3 討論與結(jié)論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物界中通過(guò)其保守的氨基酸序列（WRKYGQK）特異識(shí)別靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域W-box? [（T）TGACC（AT）]，且調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（梁濱和董冬，2018）。成功鑒定和挖掘了AtWRKY和OsWRKY基因家族的生物學(xué)特征和分子功能（谷彥冰等，2015）。WRKY基因家族在種子萌發(fā)過(guò)程、植物防衛(wèi)應(yīng)答反應(yīng)、代謝調(diào)控和發(fā)育衰老調(diào)控等生命過(guò)程中都起到重要作用（梁濱和董冬，2018）。在擬南芥WRKY抗病轉(zhuǎn)錄因子研究中，發(fā)現(xiàn)WRKY家族因子能在一定程度上提高耐受低磷脅迫的能力，對(duì)腐生病原菌起正調(diào)控作用的為AtWRKY3和AtWRKY4（Lai et al.， 2008; 陳益芳等，2010）。在煙草植物應(yīng)答病毒侵染過(guò)程研究中，推斷NtWRKY40可能是參與機(jī)械損傷脅迫和病原菌侵染的重要組分（劉晶晶等，2016）。張計(jì)育等（2015）在獼猴桃澇害脅迫研究中指出，WRKY在獼猴桃對(duì)澇害脅迫反應(yīng)起到重要作用。付冰等（2018）在研究棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)棗瘋病植原體和激素處理的應(yīng)答中，指出棗瘋病植原體侵染棗樹后，誘導(dǎo)了ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69基因的表達(dá)。許海峰等（2018）對(duì)蘋果的鹽脅迫研究發(fā)現(xiàn)，MdWRKY18和MdWRKY40受鹽脅迫的誘導(dǎo)，可形成同源或異源二聚體，并增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的耐性?？傊?，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在直接參與植物的生命活動(dòng)中具有關(guān)鍵作用（Gao et al.， 2016）。

本研究發(fā)現(xiàn)中?？Х萕RKY蛋白家族的氨基酸總數(shù)在103～994個(gè)之間，氨基酸平均為376個(gè)，等電點(diǎn)范圍為5.03～9.62。這與同源性較高的棗（薛寶平等，2018）、蘋果（Bhattarai， 2010）WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究的結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)中粒咖啡WRKY蛋白家族都是不含跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性穩(wěn)定蛋白，都無(wú)信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位都在細(xì)胞核中，說(shuō)明該蛋白是在細(xì)胞內(nèi)合成后運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核后起作用;WRKY蛋白在絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸處都有磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)該蛋白是通過(guò)磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能的調(diào)控;49種WRKY轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)均主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)可以分為6類，其中以D類為主。Robatzek et al.（2002）研究表明，AtWRKY61有可能參與植物免疫信號(hào)通路;通過(guò)與AtWRKY72共同參與植物的抗病信號(hào)通路（Bhattarai， 2010）;擬南芥中WRKY6參與到植物防衛(wèi)反應(yīng)及葉片的衰老過(guò)程中（Robatzek et al.， 2002）;AtWRKY7參與了擬南芥的天然免疫反應(yīng)（Journot-Catalino et al.， 2006）。從本研究中?？Х萕RKY蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，D類比較穩(wěn)定，D類中有與AtWRKY61、AtWRKY72、AtWRKY6和AtWRKY7的對(duì)應(yīng)關(guān)系，推測(cè)中?？Х萕RKY可能參與植物免疫、植物抗病信號(hào)通路，也可能參與到植物防衛(wèi)反應(yīng)及葉片的衰老與天然免疫反應(yīng)的過(guò)程中。本研究從保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析可以看出，Cc00_g01860、Cc00_g05270、Cc00_g05280、Cc00_g39120和Cc08_g15910，5個(gè)成員保守基序只含有2個(gè)，分別為Motif1與Motif2，可將它們分為1個(gè)大類，這與WRKY蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹的結(jié)果是一致的，這些成員都在Group 6。WRKY結(jié)構(gòu)域既包含保守的七肽結(jié)構(gòu)（WRKYGQK），又包含1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)（C2HC），并且C2HC結(jié)構(gòu)只存在第Ⅲ家族的WRKY結(jié)構(gòu)域（李曉穎等，2019），這與在棗（薛寶平等，2018）等其他物種上的研究結(jié)果相似。本研究中，中?？Х萕RKY轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白序列可以分為6組，從中?？Х萕RKY47基因與煙草、獼猴桃和擬南芥等11種物種構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以得到中?？Х萕RKY47與煙草親緣關(guān)系最近，序列同源性也較高，與非洲油棕親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

本研究在中?？Х然蚪M中發(fā)現(xiàn)49個(gè)WRKY基因，對(duì)該家族基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域和分子進(jìn)化等進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，為后續(xù)研究中?？Х萕RKY分子功能、進(jìn)化起源關(guān)系及其逆境脅迫機(jī)制提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

BAKSHI M， OELMLLER R， 2014. WRKY transcription factors： jack of many trades in plants [J]. Plant Signal Behav， 9（2）： e27700.

BAO CY， DENG L， ZHOU J， et al.， 2018. Genome-wide identification and analysis of WRKY transcription factor family in kiwifruit [J]. Mol Plant Breed， 16：（14）： 4473-4488.? [包昌艷， 鄧?yán)耍?周軍， 等， 2018. 獼猴桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組鑒定與分析 [J]. 分子植物育種， 16（14）：

4473-4488.]

BHATTARAI KK， ATAMIAN HS， KALOSHIAN I， et al.， 2010.WRKY72-type transcription factors contribute to basal immunity in tomato and Arabidopsis as well as gene-for-gene resistance mediated by the tomator gene mi-1 [J]. Plant J， 63（2）： 229-240.

BUDE RG， BAO ML， ZHANG HX， et al.， 2017. Bioinformatics analysis of WRKY transcription factor genes family in melon [J]. Genom Appl Biol， 36（11）： 4761-4769.? [巴德仁貴， 鮑牧蘭， 張紅霞， 等， 2017. 甜瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因生物信息學(xué)分析 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 36（11）：? 4761-4769.]

CHEN YF， XU Q， WANG H， et al.， 2010. Functional analysis of Arabidopsis WRKY transcription factor in plant response to low phosphorus stress [G]. Abstract Compilation of Papers on Plant Cell Biology 2010 Annual meeting of the Chinese Botany Society.? [陳益芳， 徐謙， 王慧， 等， 2010. 擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)低磷脅迫中的功能分析 [G]. 中國(guó)植物學(xué)會(huì)植物細(xì)胞生物學(xué)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編.]

CHENG T， WEI Q， LI GL， 2016. Bioinformatics analysis of the TPS gene family in Coffea canephora [J]. Chin Bull Bot， 51（2）： 235-250.? [程甜， 魏強(qiáng)， 李廣林， 2016. 中?？Х容祁惡铣擅富蚣易宓纳镄畔W(xué)分析 [J]. 植物學(xué)報(bào)， 51（2）： 235-250.]

DING M， CHEN J， JIANG Y， et al.， 2015. Genome-wide investigation and transcriptome analysis of the WRKY gene family in Gossypium [J]. Mol Genet Genom， 290（1）： 151-171.

DONG X， YANG Y， ZHANG Z， et al.， 2019. Genome-wide identification of WRKY genes and their response to cold stress in Coffea canephora [J]. Forests， 10（4）： 335.

EULGEM T， RUSHTON PJ， ROBATZEK S， et al.， 2000. The WRKY superfamily of plant transcription factors [J]. Trends Plant Sci， 5：200-206.

FU B， YE X， WANG HY， et al.， 2018. Identification of WRKY transcription factors in jujube and their responses to ‘Candidatus Phytoplasma ziziphi’ and salicylic acid or methyl jasmonate treatments [J]. Sci Silv Sin， 54（8）： 65-78.? [付冰， 葉霞， 王會(huì)魚， 等， 2018. 棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及其對(duì)棗瘋病植原體和激素處理的應(yīng)答 [J]. 林業(yè)科學(xué)， 54（8）： 65-78.]

GAO R， LIU P， YONG YH， et al.， 2016. Genome-wide transcriptomic analysis reveals correlation between higher WRKY61 expression and reduced symptom severity in turnip crinkle virus infected Arabidopsis thaliana [J]. Sci Rep， 6（1）： 24604.

GU YB， JI ZR， CHI FM， et al.， 2015. Bioinformatics and expression analysis of the WRKY gene family in apple [J]. Sci Agric Sin， 48（16）： 3221-3238.? [谷彥冰， 冀志蕊， 遲福梅， 等， 2015. 蘋果WRKY基因家族生物信息學(xué)及表達(dá)分析 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 48（16）： 3221-3238.]

ISHIGURO S， NAKAMURA K， 1994. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the 5’upstream regions of genes coding for sporamin and β-amylase from sweet potato [J]. Mol Gen Genet， 244（6）： 563-571.

JOURNOT-CATALINO N， SOMSSICH IE， ROBY D， et al.， 2006. The transcription factors WRKY11 and WRKY17 act as negative regulators of basal resistance in Arabidopsis thaliana [J]. Plant Cell， 18（11）： 3289-3302.

KELLEY LA， MEZULIS S， YATES CM， et al.， 2015. The Phyre2 web portal for protein modeling， prediction and analysis [J]. Nat Protoc， 10（6）： 845-858.

KUMAR S， STECHER G， LI M， et al.， 2018. MEGA X： molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms [J]. Mol Bio Evol， 35（6）： 1547-1549.

LAGAC M， MATTON DP， 2004. Characterization of a WRKY transcription factor expressed in late torpedo-stage embryos of Solanum chacoense [J]. Planta， 219（1）： 185-189.

LAI ZB， VINOD KM， ZHENG ZY， et al.， 2008. Roles of Arabidopsis WRKY3 and WRKY4 transcription factors in plant responses to pathogens [J]. BMC Plant Biol， 8（1）： 68.

LI XY， XU HX， CHEN JW， 2019. Identification and expression analysis of WRKY transcription factors in Eriobotrya japonica [J]. Acta Hort Sin， 46（5）： 939-954.? [李曉穎， 徐紅霞， 陳俊偉， 2019. 枇杷WRKY轉(zhuǎn)錄因子鑒定與表達(dá)分析 [J]. 園藝學(xué)報(bào)， 46（5）： 939-954.]

LI Z， HAN X， ZHANG YH， et al.， 2019. Cloning and functional analysis of a phosphorus stress response gene GhWRKY6， in cotton （Gossypium hirsutum L.）? [J]. Cotton Sci， 31（3）： 182-191.? [李智， 韓笑， 張一豪， 2019. 棉花磷脅迫響應(yīng)基因GhWRKY6克隆及功能分析 [J]. 棉花學(xué)報(bào)， 31（3）： 182-191.]

LIANG B， DONG D， 2018. Advances in WRKY transcription factors in plants [J]. Bull Biol， 53（6）： 5-8.? [梁濱， 董冬， 2018. 植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展 [J]. 生物學(xué)通報(bào)， 53（6）： 5-8.]

LIU JJ， CHENG CL， XI YZ， et al.， 2016. Roles of Nicotiana tobacum NtWRKY40 in plant responding to virus infection [J]. Biotechnol Bull， 32（10）： 188-198.? [劉晶晶， 程春玲， 席玉珍， 等， 2016. 煙草NtWRKY40在植物應(yīng)答病毒侵染過(guò)程中的作用 [J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 32（10）： 188-198.]

MONENTE C， LUDWIG IA， IRIGOYEN A， et al.， 2015. Assessment of total （free and bound） phenolic compounds in spent coffee extracts [J]. J Agric Food Chem， 63（17）： 4327-4334.

ROBATZEK S， SOMSSICH IE， 2010. A new member of the Arabidopsis WRKY transcription factor family， AtWRKY6， is associated with both senescence- and defence-related processes [J]. Plant J， 28（2）： 123-133.

ROBATZEK S， SOMSSICH IE， 2002. Targets of AtWRKY6 regulation during plant senescence and pathogen defense [J]. Gene Dev， 16（9）： 1139-1149.

RODRIGUES NP， SALVA TDJ， BRAGAGNOLO N， 2015. Influence of coffee genotype on bioactive compounds and the in vitro capacity to scavenge reactive oxygen and nitrogen species [J]. J Agric Food Chem， 63（19）： 4815-4826.

RUSHTON DL， TRIPATHI P， RABARA RC， et al.， 2012. WRKY transcription factors： key components in abscisic acid signalling [J]. Plant Biotechnol J， 10（1）： 2-11.

SHA T， LI YJ， ZHANG FB， et al.， 2019. Antigenic epitopes of echinococcus granulosus proteins： egG1y162-1 and egG1y162-2： a comparative study [J]. J Xinjiang Med Univ， 42（1）： 12-19. [沙桐， 李玉嬌， 張峰波， 等， 2019. 細(xì)粒棘球絳蟲蛋白egG1y162-1， egG1y162-2的抗原表位比較 [J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 42（1）： 12-19.]

SU L， WANG PF， YANG Y， et al.， 2019， Genome-wide identification and analysis of WRKY transcription factors in grape [J]. Heilongjiang Agric Sci， （1）： 13-22. [蘇玲， 王鵬飛， 楊陽(yáng)， 等， 2019.葡萄全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子鑒定和分析 [J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)， （1）： 13-22.]

WANG PY， QU SS， LIANG Y， et al.， 2019. Bioinformatics analysis of WRKY transcription factor family in rice [J]. J Anhui Agric Sci， 47（12）： 123-126. [王鵬洋， 曲姍姍， 梁源， 等， 2019. 水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 47（12）： 123-126.]

WU X， SHIROTO Y， KISHITANI S， et al.， 2009. Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing Oswrky11 under the control of hsp101 promoter [J]. Plant Cell Rep， 28（1）： 21-30.

XIE ZW， WANG LJ， CHEN JY， et al.， 2016. Studies on WRKY transcription factors and their biological functions in plants [J]. J Agric Sci Technol Chin， 18（3）： 46-54. [謝政文， 王連軍， 陳錦洋， 等， 2016. 植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 18（3）： 46-54.]

XU HF， YANG GX， ZHANG J， et al.， 2018. Molecular mechanism of apple MdWRKY18 and MdWRKY40 participating in salt stress [J]. Sci Agric Sin， 51（23）： 4514-4521. [許海峰， 楊官顯， 張靜， 等， 2018. 蘋果MdWRKY18和MdWRKY40參與鹽脅迫途徑分子機(jī)理研究 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 51（23）： 4514-4521.]

XU YH， WANG JW， WANG S， et al.， 2004. Characterization of GaWRKY1， a cotton transcription factor that regulates the sesquiterpene synthase gene （+）-δ-cadinene synthase-A1 [J]. Plant Physiol， 135（1）： 507-515.

XUE BP， ZHANG H， ZU HH， et al.， 2018. Bioinformatics analysis of the WRKY transcription factor family in Ziziphus jujuba [J]. Mol Plant Breed， 16（14）： 4543-4558.? [薛寶平， 張昊， 祖歡歡， 等， 2018. 棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析 [J]. 分子植物育種， 16（14）： 4543-4558.]

YAN L， HUANG LF， WANG XY， et al.， 2018. Comparative trial of robusta coffee cultivars [J]. Chin J Trop Crop， 39（7）： 1276-1281. [閆林， 黃麗芳， 王曉陽(yáng)， 等， 2018. 中粒種咖啡品種比較試驗(yàn) [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 39（7）： 1276-1281.]

YANG HG， 2014. Effects of drought stress on lipid peroxidation， antioxidant enzyme activities and osmolyte content in leaves of Coffea canephora seedlings [J]. Chin J Trop Crop， 35（5）： 944-949. [楊華庚， 2014. 干旱脅迫對(duì)中粒種咖啡幼苗膜脂過(guò)氧化、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響 [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 35（5）： 944-949.]

YU CS， CHEN YC， LU CH， et al.， 2006. Prediction of protein subcellular localization [J]. Proteins， 64（3）： 643-651.

ZHANG CL， MAN LL， XIANG DJ， et al.， 2018. Cloning and bioinformatics analysis of BjSnRK2C gene from Potherb mustard [J]. Acta Agric Boreal-Sin， 33（6）： 24-32.? [張春蘭， 滿麗莉， 向殿軍， 等， 2018. 雪菜BjSnRK2C基因的克隆及生物信息學(xué)分析 [J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 33（6）： 24-32.]

ZHANG H， 2017. Bioinformatics analysis of WRKY transcription factor family and identification of some genes related to stress resistance in tomato [D]. Harbin： Northeast Agricultural University [張紅， 2017. 番茄WRKY轉(zhuǎn)錄家族生物信息學(xué)分析及部分抗逆相關(guān)基因鑒定 [D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué).]

ZHANG JY， HUANG SN， MO ZH， et al.， 2015. Transcriptional sequencing and comparative analysis of the different expression genes of Actinidia chinensis under the drought stress [C]. Annual Meeting of Chinese Society for Horticultural Science in 2015. [張計(jì)育， 黃勝男， 莫正海， 等， 2015. 澇害脅迫下獼猴桃差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及比較分析 [C]. 中國(guó)園藝學(xué)會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì).]

ZHANG L， HE XJ， LIN C， et al.， 2019. Expression and functional prediction of WRKY transcription factors in leaf senescence of tobacco ‘Yunyan 87’ [J]. Mol Plant Breed， 17（8）. [張柳， 何曉健， 林春， 等， 2019. 煙草‘云煙 87’葉片衰老中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及功能預(yù)測(cè) [J]. 分子植物育種， 17（8）.]

ZHENG C， ZHENG ES， WANG YM， et al.， 2018. Research progress on rice WRKY transcription factors [J]. Lett Biotechnol， 29（2）： 286-294. [鄭超， 鄭二松， 王栩鳴， 等， 2018. 水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子研究進(jìn)展 [J]. 生物技術(shù)通訊， 29（2）： 286-294.]

ZHOU J， HUANG J， 2018. Cloning and functional identification of chitinase gene SlChi in Salix [J]. Mol Plant Breed， 16（24）： 8013-8021. [周潔， 黃婧， 2018. 柳樹幾丁質(zhì)酶基因SlChi的克隆和功能驗(yàn)證 [J]. 分子植物育種， 16（24）： 8013-8021.]

ZOU Z， 2013. Genome-wide identification and phylogenetic analysis of WRKY transcription factor family in castor bean [J]. Oil Crop Sci， 35（1）： 36-42. [鄒智， 2013. 蓖麻WRKY轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定及其進(jìn)化分析 [J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)， 35（1）： 36-42.]

ZHOU J， HUANG J，2018. Cloning and functional identification of chitinase gene SlChi in Salix [J]. Mol Plant Breed， 16（24）： 8013-8021. [周潔，黃婧，2018. 柳樹幾丁質(zhì)酶基因SlChi的克隆和功能驗(yàn)證 [J]. 分子植物育種， 16（24）：8013-8021.]

（責(zé)任編輯 蔣巧媛）