李嘉惠 歐曉華 鄧文靜 羅可可 張宏意 何夢玲 嚴(yán)寒靜

摘 要：? 為保護(hù)何首烏遺傳種質(zhì)多樣性，該文運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記方法探究了44個產(chǎn)地327份何首烏種質(zhì)的遺傳多樣性和居群結(jié)構(gòu)，采用3種取樣策略及6種比例抽樣模式構(gòu)建核心種質(zhì)庫，經(jīng)t檢驗(yàn)比較后篩選較優(yōu)的核心種質(zhì)構(gòu)建方法和具有代表性的核心種質(zhì)。結(jié)果表明：（1）何首烏種質(zhì)遺傳多樣性較豐富，其觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（H）分別為1.984 3、1.454 9、0.271 7和0.417 9，另外何首烏種質(zhì)居群間遺傳分化程度大，基因交流較少，基因差異分化系數(shù)（Gst）為0.753 1，基因交流值（Nm）僅有0.163 9。（2）根據(jù)樣品間遺傳距離，采用鄰接法對樣品進(jìn)行聚類，聚類結(jié)果顯示327份樣品主要分成四大類，樣品分組結(jié)果與地理分布相符，相同采集點(diǎn)樣品可聚在同一類中。（3）居群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，當(dāng)K=16時，其ΔK值最大，說明樣品分成16個類群時最佳，同時大部分何首烏樣品的血統(tǒng)組成較單一（Q>0.600），相同采集點(diǎn)樣品血統(tǒng)組成相似，可大致歸在同一類群中。（4）t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，采用居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣和10%抽樣比例構(gòu)建的種質(zhì)庫，4個遺傳參數(shù)的保留率高，Na、Ne、I和H的保留值分別為99.0%、101.9%、106.4%和105.9%，樣品量較少，且多樣性與原種質(zhì)庫無明顯差異（P>0.05）。（5）核心種質(zhì)庫由34份樣品組成，包括9份栽培樣品和25份野生樣品，主要來源于四川、重慶和貴州。該研究構(gòu)建的核心種質(zhì)庫能代表原種質(zhì)庫的遺傳多樣性，可為種質(zhì)資源的收集和新品種的選育提供參考，所采用的研究方法對其他植物核心種質(zhì)庫的構(gòu)建具有一定參考意義。

關(guān)鍵詞： 何首烏， 核心種質(zhì)構(gòu)建， SRAP， 遺傳多樣性， 居群結(jié)構(gòu)

中圖分類號：? Q948

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）11-1920-11

Construction of core germplasm bank of Fallopia multiflora using SRAP molecular markers

LI Jiahui1， OU Xiaohua1， DENG Wenjing1， LUO Keke1， ZHANG Hongyi1，2， HE Mengling1，2， YAN Hanjing1，2*

（ 1. School of Traditional Chinese Medicine Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. Key Laboratory of State

Administration of Traditional Chinese Medicine for Production & Development of Cantons Medicinal Materials， Guangzhou 510006， China）

Abstract：? In order to protect the genetic diversity of Fallopia multiflora， in this study，? SRAP molecular marker method was used to explore the genetic diversity and population structure of 327 F. multiflora samples from 44 habitats. Three sampling strategies and six proportional sampling modes were used to construct the core germplasm bank. After t-Test comparison， the better core germplasm construction method and the representative core germplasm samples were selected. The results were as follows： （1） The genetic diversity of F. multiflora germplasm was abundant， and number of observed alleles （Na）， number of effective alleles （Ne）， Shannon information index （I） and Nei’s genetic diversity index （H） were 1.984 3， 1.454 9， 0.271 7 and 0.417 9， respectively. In addition， the population of F. multiflora germplasm showed a high degree of genetic differentiation， but less gene exchange， with a gene differentiation coefficient （Gst） of 0.753 1 and a gene flow （Nm） of 0.163 9. （2）According to the genetic distance between samples， the Neighbor-Joining method was used to cluster the samples. The results showed that the 327 samples were mainly divided into four categories. The grouping results were consistent with the geographical distribution， and the samples at the same collection point could be clustered into the same category. （3） Population structure analysis showed that?? the biggest ΔK value was obtained when K=16， indicating that the sample should be divided into 16 groups， at the same time， the lineages composition of most F. multiflora samples were relatively simple， and the samples from the same collection point had similar lineages and could be roughly grouped in the same group. （4） The t-test showed that when population structure classification-proportional sampling and 10% sampling proportion were used to construct the germplasm bank， the retention rate of the four genetic parameters was high. The retention rate of Na， Ne， I and H values were 99.0%， 101.9%， 106.4% and 105.9%， respectively， the sample size was small， and the diversity was not significantly different from the original germplasm bank （P>0.05）. （5） The core germplasm bank consisted of 34 samples， including 9 cultivated samples and 25 wild samples， mainly from Sichuan， Chongqing and Guizhou provinces. The core germplasm bank constructed in this experiment can represent the genetic diversity of the original germplasm bank， and the results can provide reference for the collection of germplasm resources and breeding of new varieties. The method used in the experiment has certain reference significance for the construction of other plant core germplasm banks.

Key words： Fallopia multiflora， construction of core germplasm， SRAP

何首烏（Fallopia multiflora）為蓼科多年生草本植物，適應(yīng)力強(qiáng)，在我國204個縣（市）均有分布（陳亞等，2011）。其喜光耐貧瘠，地下膨大的塊根和地上生長的莖藤（首烏藤）均可入藥，以塊根入藥為主，生用可以截瘧解毒、潤腸通便，炮制后可補(bǔ)益精血、固腎烏須。隨著人們生活水平的提高，具有補(bǔ)益作用的何首烏市場需求量日漸攀升。藥材市場中，野生何首烏是何首烏商品的重要來源。然而，研究人員調(diào)查結(jié)果顯示，野生何首烏的資源供應(yīng)量正以每年約15%的速度遞減（劉紅昌等，2013）。何首烏的繁殖方式包括種子繁殖、扦插繁殖、組織培養(yǎng)快速繁殖及壓條繁殖等，其中扦插繁殖操作簡單、成活率高，是目前農(nóng)戶規(guī)?；N植的常用方式。但是，長期的扦插繁殖會導(dǎo)致品種退化，從而影響何首烏藥材的質(zhì)量（曾文丹等，2016）。野生資源的枯竭和栽培種質(zhì)的退化會造成物種遺傳多樣性的減少，降低生存和適應(yīng)環(huán)境變化能力，同時也會導(dǎo)致優(yōu)良基因丟失，嚴(yán)重影響何首烏的可持續(xù)發(fā)展和利用。因此，加強(qiáng)種質(zhì)研究，進(jìn)而構(gòu)建何首烏的核心種質(zhì)庫，對何首烏資源實(shí)施有針對性和高效保護(hù)是亟待進(jìn)行的任務(wù)。然而，至今尚無何首烏核心種質(zhì)構(gòu)建的相關(guān)報道。

SRAP（sequence related amplified polymophism）標(biāo)記方法由Li & Quiros（2001）于2001年創(chuàng)立，相對其他標(biāo)記方法，其具備分布普遍、可靠性和重復(fù)性高、技術(shù)難度低和多態(tài)性高等特點(diǎn)，在植物遺傳基因圖譜、植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析以及基因轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建上均有普遍應(yīng)用（楊金華，2019）。程遠(yuǎn)輝（2007）在研究重慶地區(qū)何首烏遺傳多樣性時，較長時間使用RAPD標(biāo)記方法進(jìn)行研究，由于結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶少、重復(fù)性差，因此最終選擇SRAP標(biāo)記方法進(jìn)行研究。可見，SRAP標(biāo)記方法在何首烏遺傳多樣性研究上的優(yōu)勢。本研究利用前期篩選的13對SRAP引物對44個產(chǎn)地327份何首烏樣品的遺傳多樣性進(jìn)行研究，采用鄰接法聚類-比例取樣、居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣和最小距離逐步聚類取樣3種取樣策略，以及5%、10%、15%、20%、25%和30%共6種比例抽樣模式，通過t檢驗(yàn)對上述方法構(gòu)建的初始種質(zhì)進(jìn)行評價，篩選出較好的取樣策略和抽樣比例，從而構(gòu)建何首烏核心種質(zhì)庫。

1 材料與方法

1.1 材料

2017—2019年，采集327份何首烏葉片樣品，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為蓼科何首烏屬植物何首烏（Fallopia multiflora）。樣品覆蓋我國12個省44個地點(diǎn)，其中218份為栽培居群樣品，109份為野生居群樣品。栽培居群樣品中包含1份棱枝何首烏（Fallopia multiflora var. angulatum），原種來自廣西，栽培于廣東藥科大學(xué)藥用植物園，具體信息見表1。

1.2 PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

選用植物DNA提取試劑盒（寶生物工程有限公司，產(chǎn)品型號9768）對何首烏葉片的基因組DNA進(jìn)行提取。利用前期篩選得到的13對引物對327份何首烏基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，引物信息見表2。反應(yīng)體系的總體積為20 μL，包括10 μL premix（寶生物工程有限公司，產(chǎn)品型號RR902A），正反向引物（引物母液濃度為10 ng·μL-1）各1 μL，DNA模板40 ng，并用ddH20補(bǔ)充體積至20 μL;PCR反應(yīng)程序?yàn)镾RAP標(biāo)記方法的一般程序，即94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共5個循環(huán);94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

使用條帶識別軟件Quantity-One加人工識別的方式統(tǒng)計(jì)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖上各泳道的條帶遷移距離，相同位置有條帶則記為1，無則為0，并建立二維數(shù)據(jù)矩陣。利用NTsyspc、Popgen 32、MEGA 7和Structure 2.3.4軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得何首烏種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)、遺傳距離、樣品聚類和居群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。在居群結(jié)構(gòu)分析時，假設(shè)何首烏居群可以分成K=1～23個，并采用Evanno et al.（2005）的方法計(jì)算ΔK值，從而獲得最佳的類群數(shù)。

1.3 取樣策略和抽樣方法

設(shè)置3種取樣策略，即鄰接法聚類-比例取樣、居群結(jié)構(gòu)分組-比例取樣和最小距離逐步聚類取樣;6個抽樣比例，分別為 5%、10%、15%、20%、25%、30%，嘗試構(gòu)建何首烏的核心種質(zhì)，取樣方法的具體步驟如下。

（1）鄰接法聚類-比例取樣：根據(jù)原居群樣品間遺傳距離，通過鄰接法聚類對樣品進(jìn)行分組，以各組的Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）比值決定各組樣品的取樣數(shù)量，當(dāng)該組抽樣數(shù)目大于組內(nèi)樣品數(shù)時，則按H比值把取樣數(shù)量分配到其他組。

（2）居群結(jié)構(gòu)分組-比例取樣：通過Structure 2.3.4軟件的居群分析，獲得原居群的最佳分類組數(shù)，根據(jù)Q值對樣品進(jìn)行分類，并以各組的Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）比值決定各組樣品的取樣數(shù)量，當(dāng)組中抽樣數(shù)目大于組內(nèi)樣品數(shù)時，則按H比值把取樣數(shù)量分配到其他組。

（3）最小距離逐步聚類取樣：根據(jù)原群體各樣品的遺傳距離進(jìn)行聚類分析，在聚類結(jié)果中找出遺傳距離最小的一組，在該組中剔除其中一份樣品，另一份樣品保留下來，和其余樣品重新計(jì)算遺傳距離并進(jìn)行聚類分析，循環(huán)上述步驟，直至樣品數(shù)量符合抽樣比例。

1.4 核心種質(zhì)庫檢驗(yàn)和評價

采用t檢驗(yàn)比較初始核心種質(zhì)庫和原種質(zhì)庫的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品擴(kuò)增結(jié)果

圖1為何首烏樣品基因組DNA經(jīng)SRAP-PCR擴(kuò)增、電泳和銀染后得到的聚丙烯酰胺凝膠圖，結(jié)果顯示樣品擴(kuò)增條帶中等豐富，條帶能充分分離且清晰平整，即實(shí)驗(yàn)篩選的SRAP引物和采用的擴(kuò)增、電泳、銀染體系均適合何首烏的種質(zhì)研究。

2.2 種質(zhì)遺傳多樣性、樣品聚類和居群結(jié)構(gòu)分類

何首烏種質(zhì)遺傳多樣性結(jié)果如表3所示，13對引物在栽培和野生居群樣品中的擴(kuò)增條帶數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)數(shù)豐富，野生居群樣品的4個遺傳多樣性參數(shù)均大于栽培居群樣品，說明野生何首烏的遺傳多樣性比栽培居群的大，兩種類型何首烏的居群間基因多樣性均大于居群內(nèi)多樣性，表明種質(zhì)多樣性主要來自居群間。整個何首烏種質(zhì)資源的基因差異分化系數(shù)（Gst）為0.753 1（>0.5），表明居群間遺傳分化程度大，但居群間的基因交流較少，基因交流值（Nm）僅有0.163 9（<1.0）。另外，栽培居群間分化程度極高，但基因交流極小，推測是生產(chǎn)過程主要采用營養(yǎng)繁殖，居群間缺少基因交流所致。

通過鄰接法獲得何首烏樣品聚類分組結(jié)果（圖2），何首烏樣品主要分成4大分支：第1分支為棱枝何首烏，由于它與其余何首烏樣品均有較大的遺傳距離，因此獨(dú)立成支;第2分支包括四川的EMS1～2和貴州的所有野生居群樣品;第3分支為河南鄭州的樣品;第4分支由其余樣品組成。

經(jīng)Structure 2.3.4統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)K=16時，其ΔK值最大，說明樣品分成16個類群時最佳（圖3），并由此獲得居群結(jié)構(gòu)圖（圖4），根據(jù)劉麗華等（2009）的方法，把樣品歸納如表4所示，其中319份樣品的Q≥0.600，說明大部分何首烏種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)簡單，而EMS（1～2）、HLP1、JGB1、DZ1、JGC1及HT（1～2）樣品則血統(tǒng)相對復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)將這些樣品歸在同一類群中，用于后續(xù)核心種質(zhì)的構(gòu)建。

2.3 不同取樣策略和抽樣比例的比較

何首烏樣品在不同取樣策略和抽樣比例下所組成的初始種質(zhì)庫，其遺傳多樣性參數(shù)如表5所示， 隨抽樣比例增大， 不同取樣策略其Na值和多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)逐漸增大，而Ne值、H值和I值則先下降后上升，且3個參數(shù)的保留率均大于100%，即6個抽樣比例構(gòu)建的初始種質(zhì)遺傳多樣性均大于原種質(zhì)。

經(jīng)t檢驗(yàn)比較5%～30%抽樣比例下初始種質(zhì)庫和原種質(zhì)庫的4個遺傳參數(shù)，結(jié)果見表6。鄰接法聚類-比例取樣策略在不同抽樣比例下初始種質(zhì)庫的H值和I值與原種質(zhì)庫均存在顯著或極顯著的差異，說明采用該方法構(gòu)建核心種質(zhì)，種質(zhì)庫樣品遺傳多樣性不能反映原種質(zhì)的真實(shí)情況，而居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣和最小距離逐步聚類取樣方法在10%～20%抽樣比例下，4個遺傳參數(shù)與原種質(zhì)庫均無顯著差異，當(dāng)比例為10%時，兩種方法的4個遺傳參數(shù)值均最大，且居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣對原種質(zhì)遺傳多樣性的保留上更占優(yōu)勢，根據(jù)核心種質(zhì)庫構(gòu)建的原則：去除冗余，并以最小的資源量代表整個種質(zhì)資源的遺傳多樣性。因此，選擇居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣在10%比例下構(gòu)建核心種質(zhì)庫。

2.4 何首烏核心種質(zhì)庫構(gòu)建

采用居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣抽取原種質(zhì)庫10%的樣品所組成的核心種質(zhì)庫如表7所示，樣品數(shù)量共34份，由9份栽培居群樣品和25份野生居群樣品組成。栽培居群樣品包括與其他樣品存在明顯差異的棱枝何首烏，而野生居群樣品主要分布在四川、重慶和貴州，該地區(qū)樣品數(shù)量約占核心種質(zhì)庫總數(shù)的47%。

3 討論與結(jié)論

焦賢賢（2018）的研究表明，核心種質(zhì)的構(gòu)建可以為植物的保護(hù)和利用提供理論指導(dǎo)，并有效地提高種質(zhì)資源的管理、研究和利用效率。目前，世界各國已創(chuàng)立1 300余個種質(zhì)資源庫，保存了600多萬份各類種質(zhì)資源，而我國現(xiàn)存的約有40萬份（李榮榮，2020）。雖然藥用植物種質(zhì)資源是中藥的源頭，但由于藥用植物的核心種質(zhì)庫的建立起步較晚，因此在種質(zhì)庫的構(gòu)建上一般是沿用農(nóng)作物的方法（林丹，2018）。

核心種質(zhì)的構(gòu)建，實(shí)質(zhì)上是利用收集到的數(shù)據(jù)，根據(jù)一定原則把類似的種質(zhì)資源進(jìn)行分組，選取合適的總體取樣規(guī)模，在每組中用合理的取樣比例和取樣方法進(jìn)行抽樣， 使建立的核心種質(zhì)不僅能盡量地代表原種質(zhì)的遺傳多樣性，而且能最大程度地反映原始群體的遺傳結(jié)構(gòu)（王心迪，2016）。核心種質(zhì)構(gòu)建一般包括4個步驟，即數(shù)據(jù)采集及分析、材料分組、樣品抽樣和核心種質(zhì)檢驗(yàn)及評價。其中，樣品抽樣包括抽樣方法和抽樣比例的確立，是核心種質(zhì)構(gòu)建中的重要環(huán)節(jié)。因此，抽樣策略的選擇對核心種質(zhì)庫的優(yōu)劣起到關(guān)鍵性作用。

在材料分組上，將搜集到的材料先以相似特征為依據(jù)將種質(zhì)分類，再以一定取樣方法選擇不同類群中的種質(zhì)所形成的樣本，其遺傳差異比選取同種群體的樣本高。分組的標(biāo)準(zhǔn)和方法較多樣，目前使用最多的是聚類分組方法（姜麗媛，2018）。本研究采用SRAR分子標(biāo)記方法獲得何首烏的聚類分組結(jié)果，同時通過居群結(jié)構(gòu)分析獲得樣品的類群分組結(jié)果，作為后續(xù)樣品選擇的基礎(chǔ)。

在取樣策略上，主要包括分層取樣法、逐步聚類隨機(jī)取樣法、最小距離逐步聚類法、主成分分析法和位點(diǎn)優(yōu)先逐步聚類法。其中，分層取樣法包括4種， 分別為比例法、 對數(shù)法、 平方根法和遺傳幾何形狀代表何首烏樣品，空心圖形為栽培居群樣品，實(shí)心為野生居群樣品，填充顏色相同代表該野生樣品來自相同的省。

多樣性法（楊孟莉，2016）。本研究獲得的是離散型指標(biāo)數(shù)據(jù)，主要通過遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)來分析種質(zhì)的多樣性，由于物種多樣性在群體中分布是不均勻的，因此在前期的聚類分組和居群結(jié)構(gòu)分組的基礎(chǔ)上，根據(jù)每組遺傳多樣性指數(shù)的比例來確定組內(nèi)抽樣的數(shù)目， 最終形成了鄰接法聚類-比例取樣和居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣兩種抽樣方法。另外，由于最小逐步聚類方法為核心種質(zhì)構(gòu)建的常用方法，因此將其納入何首烏核心種質(zhì)構(gòu)建的抽樣策略中。

本研究中，何首烏核心種質(zhì)庫的構(gòu)建結(jié)果表明，雖然鄰接法聚類分組-比例取樣能使初始種質(zhì)庫的遺傳參數(shù)獲得較高的值，但與原種質(zhì)庫存在顯著差異（P<0.05）， 筆者認(rèn)為可能是鄰接法聚類對樣品的分組不夠精細(xì)，取樣時較為隨機(jī)所致。雖然實(shí)驗(yàn)采用的最小距離逐步聚類方法能較好地構(gòu)建何首烏的核心種質(zhì)，但步驟較為繁瑣，而居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣方法目前雖然較為少用，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法構(gòu)建的核心種質(zhì)庫代表性強(qiáng)且多樣性保留較高，它可以對樣品進(jìn)行精細(xì)的類群劃分，利用多樣性比值確定取樣數(shù)量避免了樣品抽取數(shù)量分配不均勻的情況，減少了冗余，且操作比最小距離逐步聚類取樣簡便，上述比較提示該方法可以推廣應(yīng)用于其他物種核心種質(zhì)庫的構(gòu)建中。

本研究采用居群結(jié)構(gòu)分類-比例取樣，在10%的抽樣比例下獲得了最佳的核心種質(zhì)庫，關(guān)于抽樣比例，大多數(shù)植物資源核心種質(zhì)的整體取樣比例在5%～30%之間， 目前還沒有研究可以確定統(tǒng)一的比例（吳茵，2017）。因此，需要根據(jù)不同植物種質(zhì)資源的收集程度、遺傳多樣性狀況和遺傳結(jié)構(gòu)等方面的具體特點(diǎn)，設(shè)定適合的取樣比例（焦賢賢，2018）。

核心種質(zhì)的構(gòu)建并非完美無缺， 盡管在構(gòu)建中選取了最佳的比例、最佳的抽樣策略、最大限度地對原始種質(zhì)進(jìn)行篩選，但仍舊會丟失某些變異類型，并且隨著資源不斷地收集，會出現(xiàn)新的變異類型。因此，為了使物種的多樣性得到長久的保存和有效利用，應(yīng)該實(shí)時對種質(zhì)庫進(jìn)行調(diào)整（姜麗媛，2018）。本研究中，重慶和四川的野生居群樣品占核心種質(zhì)的多數(shù)， 在聚類和居群結(jié)構(gòu)分析時發(fā)現(xiàn)， 上述兩個產(chǎn)地的野生樣品與其他產(chǎn)地樣品相比，在聚類分組中呈分散分布，說明兩地樣品遺傳多樣性高，提示該地區(qū)何首烏種質(zhì)遺傳多樣性豐富，今后可以加強(qiáng)兩地何首烏樣本的收集和研究，進(jìn)而不斷完善核心種質(zhì)庫。

參考文獻(xiàn)：

CHENG YH， 2007. Study on natural resources of Polygonum multiflorum Thunb in Chongqing base on SRAP analysis [D]. Chongqing： Southwest University： 23.? [程遠(yuǎn)輝， 2007. 基于SRAP分析的重慶何首烏種質(zhì)資源整理研究 [D]. 重慶： 西南大學(xué)： 23.]

CHEN Y， JIANG B， ZENG YE， 2011. Study on the geographic distribution and ecological environmental characteristics of Polygonum multiflorum based on GIS [J]. J Chin Pharm， 22（39）： 3726-3728.? [陳亞， 江濱， 曾元兒， 2011. 基于地理信息系統(tǒng)的何首烏地理分布及分布區(qū)的生境特征研究 [J]. 中國藥房， 22（39）： 3726-3728.]

EVANNO G， REGNAUT S， GOUDET J， 2005. Detecting the number of clusters individuals using the software structure： a simulation study [J]. Mol Ecol， 14（8）： 2611-2620.

JIANG LY， 2018. The wild germplasm resources evaluation and core collection establishment of Rosa rugosa [D]. Tai’ an： Shandong Agricultural University： 11-12.? [姜麗媛， 2018. 瀕危植物野生玫瑰種質(zhì)資源評價與核心種質(zhì)構(gòu)建 [D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)： 11-12.]

JIAO XX， 2018. Construction of core collection of wax gourd [D]. Nanning： Guangxi University： 6-11.? [焦賢賢， 2018. 冬瓜核心種質(zhì)的構(gòu)建 [D]. 南寧： 廣西大學(xué)： 6-11.]

LI G， QUIROS CF， 2001. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet， 103（2/3）： 455-461.

LI RR， 2020. Diversity analysis and construction of primary core collection in Tibetan turnip [D]. Hangzhou： Zhejiang University： 11.? [李榮榮， 2020. 西藏蕪菁遺傳多樣性分析與初級核心種質(zhì)的構(gòu)建 [D]. 杭州： 浙江大學(xué)： 11.]

LIN D， 2018. Analysis of genetic diversity and preliminary construction of core construction of core collection of Aquilariasinensis （Lour.） Spreng [D]. Guangzhou： Guangdong Pharmaceutical University： 4-41.? [林丹， 2018. 白木香遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)的初步構(gòu)建 [D]. 廣州： 廣東藥科大學(xué)： 4-41.]

LIU HC， LUO CL， LI JL， et al.， 2013. Habitat survey and biological characteristics study of Polygonum multiflorum germplasms in Guizhou region [J]. J Chin Med Mat， 36（6）： 864-870.? [劉紅昌， 羅春麗， 李金玲， 等， 2013. 何首烏不同種質(zhì)生境調(diào)查及在貴州地域的生物學(xué)特性研究 [J]. 中藥材， 36（6）： 864-870.]

LIU LH， WANG LX， ZHAO CP， et al.， 2009. Genetic diversity and alterations of population structure in restorers of dual cross-line hybrid wheat with thermo-photoperiod sensitive male sterile [J]. Chin J Biochem Mol Biol， 25（9）： 867-875.? [劉麗華， 王立新， 趙昌平， 等，? 2009. 光溫敏二系雜交小麥恢復(fù)系遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析 [J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報， 25（9）： 867-875.]

LIU SY， 1991.A new variety of Polygonum multiflorum [J]. Plant Divers， 13（4）： 390.? [劉壽養(yǎng)， 1991. 何首烏一新變種 [J]. 云南植物研究， 13（4）： 390.]

WANG XD， 2016. Construction and evaluation of core collectios of Momordica charantia [D]. Nanning： Guangxi University： 3.? [王心迪， 2016. 苦瓜核心種質(zhì)的構(gòu)建與評價 [D]. 南寧： 廣西大學(xué)： 3.]

WU Y， 2017. Genetic diversity analysis and establishment of the core collection of pepper germplasm resources based on SRAP， SSR markers [D]. Nanchang： Jiangxi Agricultural University： 6.? [吳茵， 2017. 基于SRAP、SSR標(biāo)記的辣椒種質(zhì)遺傳多樣性分析與核心種質(zhì)構(gòu)建 [D]. 南昌： 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)： 6.]

YAN HJ， FANG ZJ， ZHANG HY， et al.， 2011. Fallopia multiflora var. angulata， a new combination in the Polygonaceae from China [J]. Novon， 21（3）： 388-391.

YANG JH， 2019. Application of SRAP marker in plant research [J]. Seed Sci Technol， 37（7）： 55.? [楊金華， 2019. SRAP標(biāo)記在植物研究中的應(yīng)用 [J]. 種子科技， 37（7）： 55.]

YANG ML， 2016. The germplasm evaluation and core collection construction of Cornus officinalis based on ISSR markers [D]. Zhengzhou ： Henan Agricultural University： 9.? [楊孟莉， 2016. 基于ISSR分子標(biāo)記的山茱萸種質(zhì)資源評價與核心種質(zhì)構(gòu)建 [D]. 鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)： 9.]

ZENG WD， LU LY， XIE XY， et al.， 2016. Advances in reproductive technology of Polygonum multiflorum [J]. Chin Trop Agric， 70（3）： 66-68.? [曾文丹， 陸柳英， 謝向譽(yù)， 等， 2016. 何首烏繁殖技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)， 70（3）： 66-68.]

（責(zé)任編輯 蔣巧媛）