趙 麗， 關(guān)繼奎， 陳嘉峰

隨著食入性酒精的大量攝入，酒精中毒(alcoholism)引發(fā)腦血管病變及腦組織損傷的病例在我國(guó)日漸增多。雖然目前國(guó)內(nèi)外對(duì)酒精中毒導(dǎo)致腦血管病變的機(jī)制已經(jīng)有了深入研究，但是對(duì)于腦血管及腦組織的超微結(jié)構(gòu)的損傷報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)制備了大鼠酒精中毒的動(dòng)物模型，并通過(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)察酒精中毒組大鼠與對(duì)照組大鼠腦血管及腦組織超微結(jié)構(gòu)的改變，并對(duì)兩者之間的聯(lián)系進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠38只，體重200～300 g，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。同一批大鼠隨機(jī)分為酒精中毒組22只與對(duì)照組16只，每籠5～6只，分籠飼養(yǎng)，按晝夜時(shí)程在室溫及穩(wěn)定濕度條件下以平衡飼料喂養(yǎng)，自然飲水。

1.1.2 主要試劑 食用酒精；無(wú)水乙醇(上海建原化工有限公司)；甲醛(山西開(kāi)原化工廠(chǎng))；蒸餾水；生理鹽水。

1.2 方法 酒精中毒大鼠動(dòng)物模型制備：Wistar雄性大鼠正常喂養(yǎng)1 w后開(kāi)始造模。酒精中毒組：每天每只大鼠按8 ml/kg以50%食用酒精分兩次進(jìn)行灌胃，其間間隔6 h，2 w后改為每天每只大鼠按10 ml/kg用50%食用酒精分兩次進(jìn)行灌胃，1 w后再改為每天每只大鼠 按12 ml/kg用50%食用酒精分兩次進(jìn)行灌胃，其間間隔均為6 h，共灌胃4 w。對(duì)照組：同時(shí)用等量生理鹽水進(jìn)行灌胃。兩組大鼠均灌胃4 w后應(yīng)用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛及2%戊二醛按照1∶1體積配制的固定液經(jīng)升主動(dòng)脈灌注固定后取出腦組織，切成1 mm3的組織塊置于3%的戊二醛中固定，逐級(jí)酒精脫水，Epon812定向包埋，超薄切片為700A厚度，經(jīng)檸檬酸鉛及醋酸鈾染色，切片通過(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)察腦部超微結(jié)構(gòu)改變并探討腦功能損失相關(guān)機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)組最終可用于實(shí)驗(yàn)的大鼠15只，灌胃4 w后存活12只，死亡率為20%。2 w后對(duì)照組大鼠能夠適應(yīng)灌胃操作，體重正常增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組大鼠始終存在灌胃困難。并逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)干枯、脫落、倦怠、進(jìn)食量減少、營(yíng)養(yǎng)不良、消瘦等情況。灌胃2 w后約1/4的大鼠出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷表現(xiàn)：偏側(cè)肢體癱瘓及病變側(cè)霍納氏征。3 w后兩組大鼠的體重(g)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，4 w后兩組大鼠體重差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 兩組大鼠存活及體重(g)比較

2.2 超微結(jié)構(gòu)改變 對(duì)照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞為單層扁平上皮細(xì)胞，細(xì)胞表面有微絨毛突起。細(xì)胞核內(nèi)周邊處為染色較深的異染色質(zhì)，常染色質(zhì)(chromatin)位于細(xì)胞核的中央部分，染色較淺，分布均勻。核仁(nucleolus)明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富(見(jiàn)圖1)。造模組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞同樣為單層扁平上皮細(xì)胞，但細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面的微絨毛突起明顯減少，常染色質(zhì)分布不均勻，異染色質(zhì)增多，并可見(jiàn)丘狀突起。核仁不明顯。細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)內(nèi)細(xì)胞器明顯減少(見(jiàn)圖2)。對(duì)照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核為橢圓形，核膜完整，異染色質(zhì)染色較深，位于周邊，常染色質(zhì)染色較淺，分布均勻，位于中央。并可見(jiàn)多個(gè)核孔。核仁明顯，形狀規(guī)則(見(jiàn)圖3)。造模組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜斷裂，染色質(zhì)分布不均勻，見(jiàn)不到核孔，核仁不明顯，形狀不規(guī)則(見(jiàn)圖4)。對(duì)照組大鼠海馬(hippocampus)內(nèi)的髓鞘結(jié)構(gòu)(brain myelination)為由多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣結(jié)構(gòu)。其切面呈同心圓狀(見(jiàn)圖5)。造模組大鼠海馬內(nèi)可見(jiàn)輕度脫髓鞘改變，多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣髓鞘有輕度脫落及破壞(見(jiàn)圖6)。對(duì)照組大鼠額葉內(nèi)線(xiàn)粒體(mitochondrion)為扁橢圓形，由兩層單位膜包圍而成，由內(nèi)膜折疊形成的嵴為彎曲的管狀，嵴平行排列，數(shù)目較多，嵴的切面為小泡狀或者短管狀。嵴上附有核糖體(ribosome)(見(jiàn)圖7)。造模組大鼠額葉內(nèi)的線(xiàn)粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴出現(xiàn)斷裂，數(shù)目減少，排列不規(guī)則。嵴上附著的核糖體有脫落(見(jiàn)圖8)。對(duì)照組大鼠額葉內(nèi)可見(jiàn)大量的管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough surfaced endoplasmic reticulum，RER)，彼此緊密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖體，核糖體為單個(gè)散在或者以多聚核糖體的形式存在(見(jiàn)圖9)。造模組大鼠額葉內(nèi)管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，長(zhǎng)度減短，彼此間隔增寬，數(shù)量明顯減少，分布不規(guī)則，管膜外表面附有的核糖體脫失(見(jiàn)圖10)。

圖1 對(duì)照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面有微絨毛突起。細(xì)胞核周邊為異染色質(zhì)，常染色質(zhì)位于中央，分布均勻。核仁明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富(×12000)。圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面的微絨毛突起明顯減少，常染色質(zhì)分布不均勻，異染色質(zhì)增多，可見(jiàn)丘狀突起。核仁不明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯減少(×12000)。圖3 對(duì)照組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核為橢圓形，核膜完整，并可見(jiàn)多個(gè)核孔。核仁明顯，形狀規(guī)則(×20000)。圖4 實(shí)驗(yàn)組大鼠小腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜斷裂，染色質(zhì)分布不均勻，見(jiàn)不到核孔，核仁不明顯，形狀不規(guī)則(×20000)。圖5 對(duì)照組大鼠海馬內(nèi)髓鞘為多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣結(jié)構(gòu)。其切面呈同心圓狀(×40000)

圖6 實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬內(nèi)可見(jiàn)輕度脫髓鞘改變，多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣髓鞘有輕度的脫落及破壞(×40000)。圖7 對(duì)照組大鼠額葉內(nèi)線(xiàn)粒體為扁橢圓形，由兩層單位膜包圍，內(nèi)膜折疊形成嵴，平行排列，數(shù)目較多，嵴的切面為小泡狀或者短管狀。嵴上附有核糖體(×80000)。圖8 實(shí)驗(yàn)組大鼠額葉內(nèi)線(xiàn)粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴斷裂，數(shù)目減少，排列不規(guī)則。嵴上附著的核糖體有脫落(×80000)。圖9 對(duì)照組大鼠額葉內(nèi)可見(jiàn)大量管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，彼此緊密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖體，核糖體為單個(gè)散在或者以多聚核糖體的形式存在(×50000)。圖10 實(shí)驗(yàn)組大鼠額葉內(nèi)管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，長(zhǎng)度減短，彼此間隔增寬，數(shù)量明顯減少，分布不規(guī)則，管膜外表面附有的核糖體脫失(×50000)

3 討 論

慢性酒精中毒可引起體內(nèi)生物酶活性改變，導(dǎo)致基本新陳代謝異常，同時(shí)還引起大量細(xì)胞毒性反應(yīng)[1]。研究表明酒精中毒會(huì)引起胚胎發(fā)育期的浦肯野細(xì)胞和其他神經(jīng)細(xì)胞變性，引起神經(jīng)軸索變性，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。大腦海馬體主要負(fù)責(zé)長(zhǎng)、短時(shí)間記憶、存儲(chǔ)轉(zhuǎn)換和定向等功能，是幫助人類(lèi)處理長(zhǎng)期學(xué)習(xí)與記憶聲光、味覺(jué)等事件的主要區(qū)域。從1950年起，科學(xué)家就已經(jīng)注意到大腦海馬區(qū)與記憶間的關(guān)系，海馬體在大腦中幫助人體記憶分析，記憶篩選，是人體的記憶系統(tǒng)，發(fā)揮所謂的“敘述性記憶”功能。海馬神經(jīng)元的退變是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能減退的直接原因[3]。我們?cè)诰凭卸敬笫蟮暮ｑR區(qū)發(fā)現(xiàn)由多層質(zhì)膜構(gòu)成的板層樣髓鞘破壞了應(yīng)有的同心圓結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)輕度脫落及破壞，是造成早期大腦認(rèn)知功能障礙的原因之一；Porter、Claude和Fullam等人于1945年發(fā)現(xiàn)，他們?cè)谟^(guān)察培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，建議叫做內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)。分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩類(lèi)。細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達(dá)程度與其生命活動(dòng)的旺盛程度呈正相關(guān)，凡蛋白質(zhì)合成旺盛的細(xì)胞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)更發(fā)達(dá)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量的高低也常反映腫瘤細(xì)胞的分化程度。在神經(jīng)細(xì)胞中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與記憶有關(guān)。慢性酒精中毒可以使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)存留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因表達(dá)激活，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress response,UPR)，從而損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[4]。UPR通過(guò)降低蛋白質(zhì)合成在有限程度上減輕蛋白質(zhì)折疊給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)帶來(lái)的負(fù)荷，但是該調(diào)解有限，蛋白質(zhì)過(guò)度堆積和鈣穩(wěn)態(tài)進(jìn)一步失衡將導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法修復(fù)，乃至凋亡[5]；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著核糖體。Palade[6]于1955年在哺乳類(lèi)與禽類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)，他將這種新細(xì)胞器描述為密集的微?；蝾w粒。核糖體是一種核糖核蛋白顆粒，主要由RNA(rRNA)和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其唯一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體脫落于胞漿內(nèi)，蛋白質(zhì)合成下降或消失。損傷恢復(fù)后其蛋白質(zhì)合成功能也隨之恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)能夠證實(shí)酒精中毒大鼠額葉內(nèi)管狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，長(zhǎng)度減短，彼此間隔增寬，數(shù)量明顯減少，分布不規(guī)則，管膜外表面附有的核糖體脫失，導(dǎo)致相關(guān)記憶性蛋白質(zhì)合成下降，也是造成認(rèn)知障礙的機(jī)制之一。但酒精中毒導(dǎo)致認(rèn)知障礙的產(chǎn)生部位及時(shí)間順序、干預(yù)措施需要進(jìn)一步探索；據(jù)Rizzuto等[7]研究，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線(xiàn)粒體之間存在很密切的關(guān)聯(lián)，二者通過(guò)膜交換鈣離子、脂質(zhì)、糖化蛋白等物質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)破壞會(huì)導(dǎo)致Ca2+攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙從而影響線(xiàn)粒體功能[8,9]。慢性酒精中毒造成機(jī)體游離自由基產(chǎn)生增多損傷神經(jīng)細(xì)胞功能，同時(shí)使線(xiàn)粒體中電子傳遞鏈活性抑制，使三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生減少及細(xì)胞損傷[10]。

本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確觀(guān)察到酒精中毒后大鼠大腦額葉皮質(zhì)細(xì)胞線(xiàn)粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴出現(xiàn)斷裂，數(shù)目減少，排列不規(guī)則。嵴上附著的核糖體有脫落。此種改變可能與UPR及ATP減少有關(guān)；酒精中毒后小腦血管的改變是導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)及運(yùn)動(dòng)障礙的基礎(chǔ)。小腦血管單層扁平上皮細(xì)胞的損傷直接導(dǎo)致小腦血液供應(yīng)障礙，我們認(rèn)為是后續(xù)運(yùn)動(dòng)功能及共濟(jì)調(diào)節(jié)障礙的病理基礎(chǔ)之一。這種酒精中毒導(dǎo)致的小腦血管細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷是否能完全修復(fù)、是否存在修復(fù)的閾值，需要我們后續(xù)研究進(jìn)一步探索。