尚芝群,陳宣蓉,田 昊,李常穎,牛遠杰

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科,天津市泌尿外科研究所,天津 300211)

在對生命奧秘探索的歷程中,人們逐漸認識到真核生物的遺傳信息主要儲存在細胞核內(nèi)且以染色質(zhì)的形式存在。染色質(zhì)主要由DNA與組蛋白組成[1]。先前的研究普遍認為解碼DNA攜帶的遺傳信息就可以解釋整個基因表達調(diào)控規(guī)律。隨著對組蛋白修飾研究的深入,人們認識到在基因表達的動態(tài)平衡調(diào)控中,組蛋白所處的修飾狀態(tài),染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)變化及染色質(zhì)可接近程度的變化也發(fā)揮著重要作用[2-4]。因此,對前列腺癌遺傳規(guī)律的解碼,將從染色質(zhì)層面揭示其發(fā)生變化規(guī)律,從而更深入的認識腫瘤的基因表達調(diào)控[5-7]。

1 染色質(zhì)可接近性的定義

基因的表達調(diào)控瞬息萬變,同時染色質(zhì)也處于動態(tài)變化中,包含組蛋白、核小體等染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[8]。真核生物中,組蛋白被DNA緊密地纏繞形成核小體,一個核小體約含有147 bp的雙螺旋DNA。接著核小體再由鏈接DNA(linker DNA)連接并進行高度折疊形成染色質(zhì),最終將總長近2 m的基因組DNA分子包裝進細胞核中[9-10]。當特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到可接近的染色質(zhì)區(qū)域后,募集轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白和RNA聚合酶,使附近的基因開始轉(zhuǎn)錄[11]。此時，由于轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)可接近區(qū)的DNA發(fā)生結(jié)合，原有的核小體被取代呈現(xiàn)出裸露狀態(tài)。[12]

研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)上不同區(qū)域的DNA對核酸酶的敏感性差異明顯,其中易受DNA酶I作用的位點稱為DNA酶I超敏感位點(DNaseI hypersensitive site)[13-14]。染色質(zhì)在染色質(zhì)重塑因子的作用下,通過改變核小體的裝配、拆解和重排等方式來發(fā)生重塑[15]。重塑后的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或趨于疏松,或趨于致密[16-17]。其中經(jīng)過重塑后結(jié)構(gòu)趨于疏松的染色質(zhì),表現(xiàn)出對DNA酶I的高度敏感,核小體結(jié)構(gòu)消失或排列松散等特性,稱為染色質(zhì)可接近性[18]。

2 研究染色質(zhì)可接近性的生物學意義

基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中,真核細胞中染色質(zhì)的可接近性處于動態(tài)變化中:處于疏松狀態(tài)的染色質(zhì)增加了轉(zhuǎn)錄因子對染色質(zhì)DNA的可接近性,使得RNA聚合酶能募集到特定DNA序列上,從而激活基因的轉(zhuǎn)錄；處于致密狀態(tài)的染色質(zhì)使得轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶對染色質(zhì)DNA的可接近性減弱,從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。以往的研究主要關(guān)注特定的某一個具有調(diào)控功能的順式作用因子和其反式作用元件在轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮的作用,同時需要借助包括RNA-seq,ChIP-seq在內(nèi)的多個組學進行切入。而當我們對染色質(zhì)可接近性在基因組層面有全局的認識后,可以了解整個轉(zhuǎn)錄的活性和惰性區(qū)域,從而更加精確的了解基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制或規(guī)律[19]?；诖烁拍?研究人員啟動了人類基因組調(diào)控元件百科全書計劃(encyclopedia of DNA elements,ENCODE),從多個角度來解碼調(diào)控元件與轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)之間復雜的相互關(guān)系[20]。

染色質(zhì)的可接近性在整個基因調(diào)控過程中也與核小體的動態(tài)定位息息相關(guān)。核小體對于染色質(zhì)DNA片段選擇的特性稱為核小體定位。于較疏松的染色質(zhì)區(qū)域來說,其擁有數(shù)量較多的核小體；對于處于較開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域來說,其擁有數(shù)量較少的核小體且大部分轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點得以暴露,使得基因的轉(zhuǎn)錄可以順利進行。當我們對轉(zhuǎn)錄失調(diào)節(jié)的腫瘤基因組無從下手時,可以轉(zhuǎn)變思路去探究失調(diào)的基因組中核小體定位、染色質(zhì)可接近性是否發(fā)生改變,便可以解碼基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的有效的調(diào)控元件,為深入認識腫瘤的基因調(diào)控提供了新的思路。

3 研究染色質(zhì)可接近性的技術(shù)

隨著第2代高通量測序技術(shù)的到來,BOYLE[21]等利用DNaseⅠ酶對染色質(zhì)上已有的超敏感位點切割的特性,將其酶切后的染色質(zhì)DNA片段進行測序文庫構(gòu)建,并進行二代測序,得到了人CD4+T細胞中數(shù)萬個DNA酶I超敏感位點?；贒Nase-seq技術(shù)可以識別不同類型的具有活性的基因調(diào)控元件[22]。FAIRE測序(FAIRE-seq)技術(shù)則是利用超聲打斷與高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方式來鑒定的開放染色質(zhì)區(qū),其利用了開放的染色質(zhì)區(qū)易于被超聲打斷的原理[23]。由于超聲打斷的技術(shù)要求和甲醛交聯(lián)的條件不易明確等缺陷而沒有被研究人員大量應(yīng)用。ATAC 測序(ATAC-seq)技術(shù)則是利用了Tn5轉(zhuǎn)座子在開放的染色質(zhì)區(qū)域的偏好插入的特性進行鑒定染色質(zhì)的可接近性[24]。由于其對樣本的需求量較低,且整個實驗流程簡單快速的優(yōu)點而受到研究人員的青睞,而廣泛應(yīng)用[25-28]。隨著人們對染色質(zhì)可接近性探索的深入,研究人員發(fā)現(xiàn)ATAC-seq存在對較大的染色質(zhì)可接近區(qū)的偏好選擇的缺點,使得較小的染色質(zhì)可接近區(qū)會被忽略。于是,SOS等[29]改進了ATAC-seq的實驗流程,發(fā)明了THS-seq(transposome hypersensitive sites sequencing)使得對染色質(zhì)可接近區(qū)的鑒定更加完整。表1對現(xiàn)有基于高通量測序手段鑒定染色質(zhì)可接近區(qū)技術(shù)進行了歸納和總結(jié)。

表1 利用高通量技術(shù)檢測開放染色質(zhì)位點的技術(shù)比較

技術(shù)名稱樣品細胞量要求(個)技術(shù)特點DNase-seq5× 106基于DNase Ⅰ特性FAIRE-seq1× 106～5× 107基于超聲打斷ATAC-seq5×102～5×104基于轉(zhuǎn)座子THS-seq1×102基于ATAC-seq基礎(chǔ)改進

4 染色質(zhì)可接近性在前列腺癌研究的應(yīng)用

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。根據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計報告,前列腺癌的發(fā)病率已高居整個男性腫瘤發(fā)病率的第二位[30]。前列腺癌中,雄激素受體(androgen receptor,AR)在維持雄性表型和前列腺癌的發(fā)生、進展中起關(guān)鍵作用[31-32]。人們發(fā)現(xiàn)AR信號通路所介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以導致前列腺上皮細胞的特異性轉(zhuǎn)化,驅(qū)動前列腺癌的發(fā)生,與去勢抵抗性前列腺癌的進展有關(guān)[33]。CHEN等[34]發(fā)現(xiàn)在雄激素或特異性配體的作用下,AR作為轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核內(nèi)來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄,引起靶基因的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制。TEWARI等[35]利用DNase-seq技術(shù)結(jié)合AR-ChIP-seq 和RNA-seq數(shù)據(jù),詳細分析了前列腺癌細胞LNCaP細胞在雄激素處理前后的基因轉(zhuǎn)錄的改變。雄激素激活后的AR會引起全基因組范圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,這些變化的位點具有明確的AR結(jié)合位點和與轉(zhuǎn)錄應(yīng)答有關(guān)等特點。與其他的DNA結(jié)合因子所不同的是,AR的結(jié)合位點不僅僅局限在雄激素處理前就已經(jīng)可以接近的染色質(zhì)區(qū)域,而是主動增加基因組其他位點的染色質(zhì)的可接近性,從而影響基因的表達[36]。以上研究指出AR-轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)之間有著動態(tài)的定量平衡關(guān)系,為前列腺癌在去勢治療前后應(yīng)答的改變建立了理論基礎(chǔ)。去勢抵抗性前列腺癌患者中大約有37%存在視網(wǎng)膜母細胞瘤基因(retinoblastoma,RB)的突變,且這種突變往往和極差的臨床預(yù)后有關(guān)。MCNAIR[37]等結(jié)合多種高通量技術(shù),從轉(zhuǎn)錄組、順反子組、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)組等多個組學出發(fā),闡明了RB蛋白的缺失差異性地重編程了E2F1在基因組的分布,改變了整個原有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從而趨向于惡性進展。利用ATAC-seq技術(shù),作者系統(tǒng)性的分析了在RB缺失前后整個染色質(zhì)的開放和關(guān)閉程度的變化情況,得出了E2F1的重編程不是由于整個染色質(zhì)的可接近程度變化引起的結(jié)論。CHEN等[34]利用ChIP-exo(chromatin immunoprecipitation-exonuclease)技術(shù)對AR蛋白不同的配體進行測序分析染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會影響AR結(jié)合。在這一觀念的基礎(chǔ)上,其又整合ATAC-seq和ChIP-exo數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)AR剪切變異體7(AR-V7)和AR蛋白在前列腺癌不同階段有著不同的結(jié)合偏好性。在進一步分析的基礎(chǔ)上,CHEN等[38-39]也發(fā)現(xiàn)HoxB13作為AR-V7驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄組的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子,表明HoxB13可以作為AR-V7驅(qū)動的前列腺腫瘤的治療靶標。利用染色質(zhì)可接近性和其他組學的整合分析,越來越受到研究者的重視和應(yīng)用。

在前列腺癌的新藥研發(fā)和臨床前藥物作用機理的研究中,染色質(zhì)組學也越來越受到人們的關(guān)注。XIAO 等[40]利用RNA-seq,ChIP-seq和ATAC-seq三個組學整合分析,發(fā)現(xiàn)使用反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)共同靶向EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)和AR后能明顯對去勢抵抗性前列腺癌產(chǎn)生抑制和殺傷作用。借助ATAC-seq作者發(fā)現(xiàn)單獨ASO靶向EZH2后,會引起染色質(zhì)的可接近性大大增強,這提示整個腫瘤細胞在藥物處理后轉(zhuǎn)錄水平可能會明顯升高。在結(jié)合ChIP-seq數(shù)據(jù)和RNA-seq數(shù)據(jù)共同分析后,該藥物可以重編程AR的順反子組同時上調(diào)整個AR信號通路,這一改變也增強了其對AR靶向藥物的敏感性。這為應(yīng)用雙靶向的ASO藥物在CRPC患者的治療提供了充足的理論基礎(chǔ)和臨床前數(shù)據(jù)支持。

在整個腫瘤的基礎(chǔ)研究中,染色質(zhì)可接近性這一概念也開始得到廣泛的認知和應(yīng)用[41-43]。無論是在對前列腺癌中特異的轉(zhuǎn)錄失調(diào)節(jié)的研究中,還是在對CRPC患者治療的藥物研發(fā)中均得到廣泛應(yīng)用。

5 展 望

利用ATAC-seq 或THS-seq 技術(shù),我們可以對整個基因組的染色質(zhì)開放與否的全貌進行觀察和分析。在整個基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)研究中,我們越來越發(fā)現(xiàn)僅僅利用一個組學是不能對整個紛繁復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程進行解讀的[25-27,44]。而將染色質(zhì)可接近性和染色質(zhì)組學融入整個轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系的研究中,會使得我們能從染色質(zhì)層面去解讀以前未能解開的轉(zhuǎn)錄謎題,使得我們能更進一步地對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行研究和應(yīng)用。