張 瑜， 李 捷， 高 元， 上官穩(wěn)

急性缺血性腦卒中是目前被全世界廣泛關(guān)注的疾病之一，其中約29%～37%的腦梗死患者[1]，在發(fā)病后其神經(jīng)功能缺損癥狀逐漸進(jìn)展或呈階梯式加重，臨床上稱作“進(jìn)展性腦梗死(progressive cerebral infarction，PCI)”[2]。

目前導(dǎo)致腦梗死進(jìn)展加重的具體病理機(jī)制尚未完全闡明，除興奮性氨基酸的毒性作用、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎性損傷外[3,4]，國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明[5,10]，細(xì)胞自噬也參與了腦缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展過程。本文通過對(duì)PCI患者早期外周血中自噬改變的探討，旨在為PCI的治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 連續(xù)收集2018年10月-2020年10月在河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性腦梗死患者123例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次發(fā)病且于24 h內(nèi)入院，并符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》所制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院后行靜脈溶栓或橋接治療；(2)合并急性心肌梗死、嚴(yán)重肝腎疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾?。?3)入院前4 w存在嚴(yán)重感染、骨折外傷、重大手術(shù)及服用免疫抑制劑。進(jìn)展性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病48 h內(nèi)神經(jīng)功能缺損癥狀逐漸進(jìn)展或呈階梯式加重(NIHSS評(píng)分增加≥2分)[7]。符合進(jìn)展性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)的納入PCI組(n=32)；符合急性腦梗死納入標(biāo)準(zhǔn)但不符合進(jìn)展性腦梗死診斷的納入NPCI組(n=91)。其中PCI組男18例，女14例，平均(66.43±13.73)歲；NPCI組男52例，女39例，平均(65.49±11.33)歲。選取的對(duì)照組(n=37)為本院體檢中心同時(shí)間段內(nèi)的健康體檢者，其中男21例，女16例，平均(63.74±12.94)歲。3組在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?、TRIzol試劑(Invitrogen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾德來)；2×SYBR?Green 預(yù)混液(中國 DF)、analytikjena-Qtower2.2 型熒光定量PCR 儀(德國)、SCILOGEX D3024R離心機(jī)(美國)、普通 PCR儀analytikjena-Easycycler(德國)，人Beclin1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、人LC3-Ⅱ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、人P62酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購自上海商紅(SRB)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基線資料 記錄PCI組和NPCI組的一般臨床資料，主要包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、吸煙、飲酒等，并采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)評(píng)估患者入院時(shí)的神經(jīng)功能缺損程度，記為基線NIHSS評(píng)分。

1.3.2 樣本收集與處理 用EDTA抗凝管和普通血清管分別抽取PCI組和NPCI組入組后次日清晨的空腹肘靜脈外周血各8 ml左右，分別用于提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)及血清。同期健康對(duì)照組的血液樣本于體檢當(dāng)日采集。(1)PBMC分離、RNA提取及cDNA合成：按差速密度梯度法分離PBMC后，應(yīng)用TRIzol試劑按說明書提取總RNA。所提取RNA溶于DEPC處理的去離子水中，用紫外分光光度法檢測RNA的濃度及純度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。(2)血清提取：將外周血以3000 r/min，離心10 min，提取上層血清后分裝到無菌凍存管中，于-80 ℃冰箱凍存待檢。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PBMC的Beclin1、LC3Ⅱ、P62 mRNA水平 取上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體積為10 μl。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；(95 ℃反應(yīng)10 s，60 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)20 s)×40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，各自噬因子及內(nèi)參基因的引物序列如下：Beclin1 上游5’-GTCCAACAACAGCACCAT-3’，下游5’-ACGGTCCAGGATCTTGAA-3’；LC3Ⅱ 上游5’-ATGTCAACATGAGCGAGTT-3’，下游5’-GTTCACCAGCAGGAAGAA-3’；P62 上游5’-AGAGACAAAGCCAAGGAG-3’，下游5’-AAGAGCATAAGCCTCACAT-3’；GAPDH上游5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4 ELISA法檢測Beclin1、LC3Ⅱ、P62蛋白水平 按照各試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 PCI組與NPCI組一般臨床資料比較 兩組研究對(duì)象在年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、吸煙、飲酒、基線NIHSS評(píng)分等危險(xiǎn)因素方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(見表1)。

表1 PCI組和NPCI組基線臨床資料的比較

2.2 自噬相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的比較 PCI組較NPCI組和對(duì)照組Beclin1和LC3Ⅱ mRNA的相對(duì)表達(dá)量增高、P62 mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。NPCI組較對(duì)照組Beclin1和LC3Ⅱ mRNA的相對(duì)表達(dá)量增高(P<0.05)、P62 mRNA的相對(duì)表達(dá)量之間無差異(P>0.05)(見表2)。

表2 3組研究對(duì)象Beclin1、LC3Ⅱ 及P62 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較 PCI組較NPCI組和對(duì)照組Beclin1和LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)量增高、P62蛋白的表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。NPCI組較對(duì)照組Beclin1和LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)量增高(P<0.05)、P62蛋白的表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 3組研究對(duì)象Beclin1、LC3Ⅱ 及P62蛋白表達(dá)量的比較

3 討 論

近年來，大量的研究證明[8～10]自噬參與了腦缺血及缺血-再灌注損傷的病理過程，并且影響神經(jīng)細(xì)胞的生存和死亡。PCI作為缺血性腦卒中的特殊類型，具有較高的致殘率和死亡率，臨床預(yù)后欠佳，但關(guān)于PCI患者外周血中自噬水平的改變目前鮮少見諸報(bào)道，故深入研究其自噬機(jī)制具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞通過自噬溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)容物的過程，自噬信號(hào)通路涉及多種因子[11～13]，其中Beclin1是自噬的直接執(zhí)行者，也是介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬小體的關(guān)鍵因子。LC3Ⅱ 反應(yīng)了自噬的激活，LC3-I轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ 的檢測可作為自噬囊泡形成的證據(jù)。P62與LC3直接結(jié)合，并被自噬所降解。因此Beclin1、LC3Ⅱ、p62 參與了調(diào)控自噬體的形成、成熟和降解的過程，故三者的表達(dá)量能夠反映細(xì)胞的自噬程度。

本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR和ELISA的方法分別檢測自噬因子的mRNA和蛋白表達(dá)量，證實(shí)健康人外周血中Beclin1、LC3Ⅱ、p62有一定程度表達(dá)，存在自噬活性。同時(shí)NPCI組較對(duì)照組beclin1、LC3Ⅱ mRNA和蛋白的表達(dá)量增高，說明腦組織發(fā)生急性缺血損傷后，自噬途徑被激活。PCI組較NPCI組的自噬水平更高，表現(xiàn)為beclin1、LC3Ⅱ 的mRNA和蛋白的表達(dá)量均增加、P62 mRNA和蛋白的表達(dá)量均降低。綜合以上結(jié)果說明，適度的自噬可幫助細(xì)胞恢復(fù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)損傷神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，但過度自噬可能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并加重缺血性損傷[14]。自噬的過度激活可能是導(dǎo)致PCI患者早期神經(jīng)功能惡化和臨床癥狀加重的發(fā)病機(jī)制之一，與Jiang[15]等的觀點(diǎn)一致。

目前自噬在腦缺血損傷中的作用仍存在爭議。Shu、Zhang等[16～18]發(fā)現(xiàn)，在腦組織缺血損傷的過程中通過施加藥物或者治療抑制自噬水平后，可以減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。Hwang、Wu等[19,20]的研究則顯示應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素提高自噬水平可以減少細(xì)胞凋亡和壞死，從而改善預(yù)后。以上研究結(jié)果不同，可能與不同的動(dòng)物或細(xì)胞模型、不同的缺血時(shí)間點(diǎn)、不同的給藥方法或預(yù)處理時(shí)間等多種因素有關(guān)。

綜上所述，通過本研究證實(shí)PCI患者早期外周血中存在自噬的過度激活，但是否調(diào)控自噬能改善PCI患者的預(yù)后，需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。