陳俊男　李治樺　賴琳英　周桂文　梁黎明　陳敏亮

[摘要]目的：本研究旨在觀察乳糜化脂肪來(lái)源干細(xì)胞條件培養(yǎng)液（Chyle fat derived stromal/stem cells-conditioned medium，CFSCs-CM）對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HSFbs）在細(xì)胞增殖、凋亡等的影響，為乳糜化脂肪改善增生性瘢痕奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：采用酶消化法從健康人腹部抽吸脂肪中獲得CFSCs，制備CFSCs-CM用于處理HSFbs，采用CCK-8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)法比較不同培養(yǎng)液對(duì)HSFbs細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白（Col Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（Col Ⅲ）、核心蛋白聚糖（Decorin，DN）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的分泌水平。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步驗(yàn)證CFSCs-CM能夠抑制HSFbs的增殖、遷移，促進(jìn)凋亡。CFSCs-CM還可以抑制HSFbs分泌Col Ⅰ，Col Ⅲ及α-SMA蛋白。CFSCs-CM對(duì)HSFbs能夠發(fā)揮抗纖維化作用。結(jié)論：CFSCs-CM可能通過(guò)旁分泌途徑來(lái)發(fā)揮抑制HSFbs的作用。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕;纖維化;脂肪來(lái)源干細(xì)胞;機(jī)制研究;條件培養(yǎng)液;成纖維細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）10-0001-05

Study on the Mechanism of Chyle Fat Derived Stem Cells Affecting Hypertrophic Scars

CHEN Jun-nan1，LI Zhi-hua1，LAI Lin-ying2，ZHOU Gui-wen2，LIANG Li-ming2，CHEN Min-liang2

[1.PLA Rocket Force Characteristic Medical Center，Beijing 100088，China;2.Department of Burn and Plastic Surgery，the Fourth Medical Centre，Chinese PLA （Peoples Liberation Army） General Hospital，Beijing 100048，China]

Abstract： Objective? The purpose of this study was to observe the effects of CFSCs-conditioned medium （CFSCs-CM） on hypertrophic scar fibroblasts （HSFbs） on cell proliferation and apoptosis. Lay an experimental foundation for the application of chyle fat to improve hypertrophic scars. Methods? Enzymatic digestion method was used to obtain CFSCs from the abdomen of healthy people. CFSCs-CM was used to treat HSFbs. CCK-8， cell scratch test， Annexin V-FITC apoptosis detection were used to compare the effects of different culture media on HSFbs cells The effects of proliferation， migration， and apoptosis. ELISA and Western Blot were used to detect the secretion level of type Ⅰ collagen （Col Ⅰ）， type Ⅲ collagen （Col Ⅲ）， decorin （DN） and α smooth muscle actin （α-SMA）. Results? The results of this experiment preliminarily verify that CFSCs-CM can inhibit the proliferation and migration of HSFbs， and can promote the apoptosis of HSFbs. In addition， CFSCs-CM can also inhibit HSFbs to secrete Col Ⅰ， Col Ⅲ and α-SMA protein. CFSCs-CM can exert anti-fibrosis effect on HSFbs. Conclusion? CFSCs-CM may inhibit HSFbs through the paracrine pathway.

Key words： hypertrophic scar; fibrosis; adipose derived stem cells（ADSCs）; mechanism research; conditioned medium; fibroblast

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）可通過(guò)其多向分化潛能及分泌功能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)血管再生，MSCs可以分泌多種具有抗纖維化作用的細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合并減少瘢痕的形成[1-4]，其中脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞更具備了促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加快血液循環(huán)建立，為瘢痕的修復(fù)提供充足的營(yíng)養(yǎng)及氧，有效改善瘢痕重塑，讓更多的研究者關(guān)注其對(duì)瘢痕的改善作用[5-6]。筆者前期開(kāi)展的自體乳糜化脂肪對(duì)人增生性瘢痕組織影響的臨床研究，觀察發(fā)現(xiàn)乳糜化脂肪對(duì)瘢痕具有良好的治療效果[7]。無(wú)獨(dú)有偶，通過(guò)建立人增生性瘢痕裸鼠移植動(dòng)物模型，觀察乳糜化脂肪注射后瘢痕的一系列轉(zhuǎn)歸，亦發(fā)現(xiàn)瘢痕發(fā)生改善。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，乳糜化脂肪能夠顯著改善瘢痕質(zhì)地，再次驗(yàn)證Tonnard[8]、Semra[9]觀點(diǎn)，認(rèn)為乳糜化脂肪的抗瘢痕作用與乳糜化脂肪來(lái)源基質(zhì)/干細(xì)胞（Chyle fat derived stromal/stem cells，CFSCs）密切相關(guān)。

上述臨床、基礎(chǔ)研究掀開(kāi)了瘢痕治療的新篇章，也讓更多的研究者嘗試將脂肪注射應(yīng)用在瘢痕的治療之中，并探索其機(jī)制。脂肪來(lái)源干細(xì)胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）對(duì)人增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞（Human hypertrophic scar fibroblast，hHSFbs）的影響及其潛在機(jī)理仍在探索中。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簭姆肿訉用?，研究CFSCs對(duì)hHSFbs生物學(xué)行為（如細(xì)胞增殖，遷移潛能和蛋白分泌水平等）的影響，對(duì)ADSCs抗纖維化及抗瘢痕形成的具體機(jī)制進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1? 材料和方法

1.1 CFSCs的分離與培養(yǎng)：取下腹部脂肪抽吸手術(shù)健康女性患者顆粒脂肪約50ml，將其通過(guò)0.5mm孔徑無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾、收集，后經(jīng)0.8mm轉(zhuǎn)換裝置（BD Luer-Lok connector）于兩5ml注射器反復(fù)推注30次，直至脂肪呈白色乳糜狀外觀，過(guò)濾后即為乳糜化脂肪。分離提取CFSCs步驟均參照Z(yǔ)uk法。將乳糜化脂肪1：1置于0.1% Ⅰ型膠原酶中，37℃水浴振蕩消化lh，加等體積10%胎牛血清終止酶消化，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，3 000rmp離心8min，棄去上層脂肪、上清，沉淀重懸接種于培養(yǎng)瓶后常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí)傳代。

1.2 hHSFbs的分離與提?。航M織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，置于lO%胎牛血清培養(yǎng)液中，37℃、5% C02培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。至細(xì)胞80%融合后進(jìn)行傳代。上述取材均得到所有患者知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 CFSCs-CM的收集：對(duì)照組條件培養(yǎng)液（Control group conditioned medium，CG-CM）：無(wú)胎牛血清的純DMEM/F12培養(yǎng)基，為空白對(duì)照組;CFSCs條件培養(yǎng)液（CFSCs conditioned medium，CFSCs-CM）：選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代CFSCs，接種于75cm2培養(yǎng)瓶，生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，換成無(wú)血清培養(yǎng)液DMEM/F12 15ml，培養(yǎng)2d后，收集上清液（CFSCs-CM），上清液0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝后凍存于-80℃冰箱備用。

1.4 CFSCs-CM對(duì)hHSFbs的處理：選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代hHSFbs以1×105細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)皿中無(wú)血清培養(yǎng)，待達(dá)到生長(zhǎng)密度及狀態(tài)要求時(shí)，更換CG-CM或CFSCs-CM，每孔接種1ml，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，對(duì)兩種培養(yǎng)液作用的細(xì)胞分別檢測(cè)。

1.5 hHSFbs細(xì)胞增殖狀況檢測(cè)：用CCK-8染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hHSFbs，以2×103細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)共兩塊96孔板，按分組加無(wú)血清培養(yǎng)基，1塊更換為CG-CM培養(yǎng)液，1塊更換為CFSCs-CM培養(yǎng)液，觀察時(shí)間點(diǎn)為1d、2d、3d、4d、5d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組6復(fù)孔，每孔加入100μl 10% CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)在450nm波長(zhǎng)下的吸光度值（OD值）。

1.6 hHSFbs遷移的測(cè)定-體外細(xì)胞劃痕法：將兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的hHSFbs，按照5×105細(xì)胞/孔接種于6孔板中，共兩個(gè)培養(yǎng)板，兩組各6復(fù)孔;鋪板24h后細(xì)胞單層融合達(dá)100%;用無(wú)菌200μl槍頭（PipetTipFinder，Knoxville，TN，USA）在培養(yǎng)板底部劃痕，建立細(xì)胞損傷模型，然后用PBS沖洗吸棄殘留細(xì)胞及死細(xì)胞，再按組更換CG-CM或CFSCs-CM，放進(jìn)37℃，5% CO2培養(yǎng)箱恒溫孵育，在倒置顯微鏡下（40×）照相，分別選時(shí)間點(diǎn)0h、24h、48h測(cè)量，用細(xì)胞遷移距離表示細(xì)胞遷移能力（率）：細(xì)胞遷移率（%）=（Gap24h或Gap48h-Gap0h）/Gap0h×100%。

1.7 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：用Annexin V-FITC（BD PharMingen，556547，USA）雙標(biāo)記法分析細(xì)胞凋亡率。兩組各接種2×105 hHSFbs于6個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶，各組重復(fù)3次。所得數(shù)據(jù)經(jīng)FlowJo軟件分析，于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況分析。

1.8 ELISA法：CFSCs-CM、CG-CM兩組的hHSFbs各于無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24h收集兩組的培養(yǎng)上清液，進(jìn)行Col Ⅰ、Col Ⅲ、DN、α-SMA的分泌水平檢測(cè)，在450nm處測(cè)量吸光度OD值。

1.9 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)（Western blot）：將細(xì)胞經(jīng)各組培養(yǎng)液處理，消化下的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，PBS清洗數(shù)次，加消化酶消化2min，離心，棄上清液，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行人膠原蛋白Col Ⅰ、Col Ⅲ及α-SMA的酶聯(lián)免疫試驗(yàn)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，組間差異比較采用ANOVA分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 CFSCs-CM對(duì)hHSFbs增殖的影響：CCK-8染色法檢測(cè)hHSFbs的增殖情況，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，CFSCs-CM處理后的hHSFbs，在1d、3d、5d收集的條件培養(yǎng)液細(xì)胞增殖活力顯著降低（P<0.05）。說(shuō)明在體外條件下，CFSCs-CM能夠抑制hHSFbs的增殖能力。見(jiàn)圖1。

2.2 CFSCs-CM減緩hHSFbs的遷移能力：自hHSFbs細(xì)胞劃痕24h后，對(duì)細(xì)胞遷移情況進(jìn)行拍照，其結(jié)果顯示，空白對(duì)照組（77.72±1.70）%劃痕區(qū)被細(xì)胞遷移而覆蓋，CFSCs-CM組（67.08±3.10）%劃痕區(qū)被爬滿，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。自hHSFbs細(xì)胞劃痕48h后，對(duì)照組（86.95±1.10）%區(qū)域被填充，CFSCs-CM組（79.80±3.20）%區(qū)域被覆蓋。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明當(dāng)采用CFSCs-CM組培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)胞遷移速度明顯慢于空白對(duì)照組。見(jiàn)圖2～3。

2.3 CFSCs對(duì)hHSFbs凋亡的影響：流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡，與空白對(duì)照組相比，CFSCs-CM組hHSFbs發(fā)生早期凋亡、晚期凋亡以及壞死細(xì)胞均明顯增加。見(jiàn)圖4。

2.4 CFSCs-CM對(duì)hHSFbs的ECM蛋白合成的影響：與空白對(duì)照組相比，CFSCs-CM處理hHSFbs 48h后，對(duì)hHSFbs合成Col Ⅰ，Col Ⅲ、DN和α-SMA有抑制作用，相關(guān)蛋白分泌水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖5。

2.5 Western Blot檢測(cè)hHSFbs細(xì)胞 Col Ⅰ蛋白表達(dá)： CFSCs-CM作用hHSFbs 48h后，hHSFbs的Col Ⅰ蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖6～7。Col Ⅲ及α-SMA蛋白結(jié)果未檢測(cè)出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

3? 討論

近年來(lái)大量研究證實(shí)自體脂肪具有明顯的拮抗組織器官纖維化作用、再生作用，能夠改善皮膚紋理、膚質(zhì)[10-11]。2013年Tonnard等[8]制備“納米脂肪（Nanofat）”，開(kāi)創(chuàng)脂肪移植新技術(shù)，臨床應(yīng)用獲得滿意療效。

現(xiàn)在，Nanofat被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于瘢痕和美容治療領(lǐng)域[9，12-13]。據(jù)此筆者在臨床上制備了類Nanofat的乳糜化濃縮物-乳糜化脂肪，前期進(jìn)行乳糜化脂肪對(duì)增生性瘢痕影響的臨床研究，乳糜化脂肪移植后的瘢痕質(zhì)地得到明顯改善。在之后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究觀察乳糜化脂肪移植后對(duì)瘢痕的一系列影響，也發(fā)現(xiàn)瘢痕較前有顯著改善變化[14]。上述前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳糜化脂肪能夠改善瘢痕質(zhì)地。筆者推測(cè)，這種改善源于乳糜化脂肪來(lái)源干細(xì)胞所發(fā)揮的組織再生與重建功能。

在研究中，先分離、收集乳糜化脂肪來(lái)源干細(xì)胞條件培養(yǎng)液（CFSCs-CM），并將其作用于增生性瘢痕源性成纖維細(xì)胞（hHSFbs），觀察CFSCs-CM對(duì)hHSFbs產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果表明，CFSCs-CM能抑制hHSFbs增殖、遷移，可誘導(dǎo)其凋亡。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同Li等[15]的研究結(jié)論一致，即CFSCs-CM能夠抑制hHSFbs增殖、遷移等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hHSFbs在CFSCs-CM干預(yù)后，細(xì)胞表達(dá)胞外基質(zhì)蛋白ColⅠ，Col Ⅲ及α-SMA明顯下降，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這提示CFSCs-CM可以抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的膠原、纖維化因子的合成。認(rèn)為上述表現(xiàn)是通過(guò)細(xì)胞水平的旁分泌效應(yīng)強(qiáng)化了CFSCs對(duì)hHSFbs的影響。體外實(shí)驗(yàn)CFSCs-CM抑制hHSFbs增殖和膠原蛋白表達(dá)，及CFSCs-CM顯著下調(diào)α-SMA水平（增生性瘢痕生物活性標(biāo)志物），證實(shí)CFSCs-CM能夠抑制增生性瘢痕中的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及抗纖維化作用。

綜上所述，本研究證實(shí)CFSCs-CM在體外實(shí)驗(yàn)中，CFSCs有針對(duì)增生性瘢痕的抗纖維化作用，是介導(dǎo)改善瘢痕性狀及質(zhì)量的關(guān)鍵細(xì)胞。推測(cè)可能是因?yàn)镃FSCs上清液中含有較多的趨化因子和生長(zhǎng)因子，通過(guò)旁分泌作用減少構(gòu)成增生性瘢痕ECM結(jié)構(gòu)膠原蛋白的合成，并促進(jìn)增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞的凋亡，繼而發(fā)揮抗瘢痕作用。這也為以后有效運(yùn)用CFSCs及CFSCs-CM抑制瘢痕提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但CFSCs-CM中含有諸多細(xì)胞因子、外泌體等介質(zhì)，到底是何種因子在瘢痕的抑制過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這些因子之間以及因子與細(xì)胞之間是否存在著相互影響，尚有待進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2020-11-13

本文引用格式：陳俊男，李治樺，賴琳英，等.脂肪源性干細(xì)胞影響增生性瘢痕的機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（10）：1-5.