劉西梅　華再東　任紅艷　肖紅衛(wèi)　李莉　華文君　張立蘋　畢延震

摘要：比較了不同來源、不同狀態(tài)組織和不同分離方法對豬成纖維細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，離體組織長時間乙醇預(yù)處理和長時間儲運會降低細(xì)胞活力，使生長速度減慢；初始原代細(xì)胞種類比較多，生長不均勻，只有傳代培養(yǎng)3代以上，才能得到比較純的成纖維細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：豬；成纖維細(xì)胞；分離；培養(yǎng)

中圖分類號：R329-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0702-02

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，原代成纖維細(xì)胞已經(jīng)成為非常特殊的資源[1]。由于試驗材料來源廣、分離培養(yǎng)條件不苛刻，細(xì)胞的分裂增殖能力強(qiáng)，適應(yīng)性好，且性狀穩(wěn)定[2，3]，同時又能模擬體內(nèi)生長狀況、生長環(huán)境簡化、生長條件明確、施加實驗因素方便、容易獲得直接活體觀察結(jié)果以及方便控制培養(yǎng)產(chǎn)物等特點[3，4]，所以成纖維細(xì)胞得以廣泛地研究和應(yīng)用。醫(yī)學(xué)上用于疾病診斷、人工皮膚、組織創(chuàng)傷修復(fù)、組織器官培養(yǎng)[1，5]；動物上用于體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因[6，7]，以實現(xiàn)瀕危畜禽保種及擴(kuò)繁、優(yōu)良品種的快速繁育、轉(zhuǎn)基因新品種培育；基礎(chǔ)研究上為遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、組織學(xué)、免疫學(xué)等提供基礎(chǔ)材料和分離培養(yǎng)模式[8]。因此，建立一種快速、實用、簡便的豬成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法成為急需。本研究比較了不同來源、不同狀態(tài)組織和不同分離方法對成纖維細(xì)胞的影響，旨在為相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

35 d的胎豬、新生小豬、成年豬；超凈工作臺、超低溫冰箱、CO2培養(yǎng)箱、眼科剪、培養(yǎng)瓶、離心管、血球計數(shù)板；乙醇、PBS溶液、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、中性蛋白酶、胰蛋白酶；青霉素、鏈霉素、臺盼藍(lán)、EDTA、DMSO。除了特別說明外，其他試劑均源于Sigma公司[1，7，9，10]。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織取樣 通過手術(shù)，從懷孕35 d的湖北白豬母豬體內(nèi)無菌取出胎兒，浸泡在PBS（100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，室溫盡快帶回實驗室無菌間，在超凈工作臺上，用鑷子去除胎兒頭、尾、四肢、心臟及其他臟器，用PBS清洗后，用眼科剪將胚胎剪碎成約1 mm的3小塊，用PBS沖洗2次，再用相應(yīng)的培養(yǎng)基洗1次，備用[9]；耳組織來自湖北白豬耳邊沿皮膚（大、小豬均可），經(jīng)剪毛、清洗、消毒、生理鹽水再清洗后，在耳邊沿?zé)o菌剪取多個皮膚約0.5 cm2，放入PBS（100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，室溫2 h內(nèi)運回實驗室，在超凈工作臺上去除表皮及皮下組織，用PBS溶液洗滌2次， 將組織剪成約1 mm的3小塊，用相應(yīng)的培養(yǎng)基洗1次，備用[6]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng)是將組織塊直接接種到培養(yǎng)皿上，或是將組織塊用0.25%中性蛋白酶在4 ℃處理2～4 h，剩余組織塊以1～2 mm間距接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)壁或培養(yǎng)皿上，加入少量DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS），置于39 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待組織塊吸附牢固后，次日補(bǔ)加培養(yǎng)液至正常體積，3 d后換液[1]；如果是細(xì)胞培養(yǎng)，則向剪碎的組織塊中加入約2倍組織塊體積的37 ℃預(yù)溫的0.25%胰酶（含0.04%EDTA），在4 ℃中消化12～16 h（期間有規(guī)律地?fù)u晃3～4次），加入DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS）終止消化；取上清液，以800 r/min離心5 min，棄上清液，然后加入培養(yǎng)液，輕輕吹打重新懸浮細(xì)胞，以5×104個/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中[9]。

1.2.3 細(xì)胞傳代 細(xì)胞在組織塊周圍生長成片時，或當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到85%～90%匯合度時傳代。加入2 mL 0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA混和溶液（Gibco）消化細(xì)胞3～4 min（細(xì)胞邊沿開始有收縮即可），加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打讓細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)入離心管，1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，計數(shù)后以5×104個/mL的密度接種于新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過5～7 d的生長后，細(xì)胞達(dá)到85%～90%匯合，再次按1∶3或1∶4比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如此反復(fù)傳代，可以進(jìn)一步純化成纖維細(xì)胞[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織塊處理

組織細(xì)胞離開身體后非常脆弱，任何處理都會對細(xì)胞造成傷害，乙醇消毒、運輸時間等會影響原代細(xì)胞的生長，其中乙醇長時間消毒對細(xì)胞的傷害最大，其次是運輸時間。培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞的生長狀況見表1。

從表1中可以看出，乙醇短時間處理組織對細(xì)胞生長沒有影響，而處理時間延長會使細(xì)胞生長減慢，但這種處理對活體組織沒有影響，即在組織沒有離開肌體前處理，不影響組織采集后細(xì)胞的生長。

由表2可見，運輸時間1～2 h對細(xì)胞生長幾乎沒有影響，然而當(dāng)運輸時間達(dá)到4 h時細(xì)胞生長活力開始降低，6 h時已不適宜作為原代細(xì)胞分離培養(yǎng)。所以分離原代成纖維細(xì)胞時，取組織后應(yīng)盡快運回實驗室培養(yǎng)，這樣可以提高成功率。

2.2 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與分離

從組織中開始分離的原代細(xì)胞種類比較多，而且生長不均勻，無法判斷成纖維細(xì)胞（圖1，圖2），只有傳代培養(yǎng)3代以上，才能得到比較純的成纖維細(xì)胞（圖3，圖4）。

培養(yǎng)7～8 d的組織塊周圍可見多邊形細(xì)胞并向四周成片生長，培養(yǎng)13 d時傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞生長迅速，約6 d細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)板；消化法得到的細(xì)胞培養(yǎng)5 d，細(xì)胞開始向周圍快速生長，大約培養(yǎng)11～12 d即可傳代，傳代后6 d細(xì)胞長滿培養(yǎng)板[6]。

3 討論

成纖維細(xì)胞是非常重要的供體細(xì)胞之一，無論是用組織塊培養(yǎng)獲得，還是用消化培養(yǎng)制備，均可獲得比較純的成纖維細(xì)胞。但前期處理會影響原代細(xì)胞的生長，特別是離體后，樣品長時間儲運會降低細(xì)胞的生長速度，乙醇長時間消毒處理直接抑制細(xì)胞的生長，樣品離體前乙醇處理對細(xì)胞的生長影響較小。其原因可能是離體前處理，乙醇被血液及組織液稀釋或帶走，進(jìn)入組織細(xì)胞的乙醇濃度不容易快速升高，對細(xì)胞活力影響小，而離體后組織細(xì)胞中的乙醇濃度很快達(dá)到峰植，直接影響了細(xì)胞的活力；離體組織長時間儲運由于沒有營養(yǎng)，細(xì)胞代謝受到影響，細(xì)胞活力有所降低，但影響較小。

組織塊和消化法分離的細(xì)胞均可用于體細(xì)胞克隆，兩者的差別在于分離細(xì)胞所用的時間長短不一，對于純度要求不高的細(xì)胞而言，消化法比組織塊法更快收獲大量的1～2代細(xì)胞。其原因是原代培養(yǎng)時，消化法原始生長點比組織塊法多很多，消化后每個細(xì)胞都可能成為一個原始生長點，而每個組織塊只是一個原始生長點，組織塊的數(shù)量限制了原始生長點數(shù)量。但兩種方法分離到的成纖維細(xì)胞傳到3代以后，其生長無差別。

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