徐大兵　佀國涵　徐祥玉　彭成林　熊又升　袁家富　趙書軍

摘要：以豬糞堆肥為原料，建立多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）與豬糞堆肥提取液的配伍技術(shù)工藝，并研究其對煙草黑脛?。≒hytophthora parasitica）土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，最佳技術(shù)工藝是多粘類芽孢桿菌添加到豬糞堆肥中發(fā)酵72 h，再按照水∶堆肥8∶1（質(zhì)量比）浸提48 h。不同工藝提取的豬糞堆肥提取液均能有效抑制煙草黑脛病病原菌的生長。與對照相比，施用輔以多粘類芽孢桿菌的堆肥提取液處理土壤疫霉ITS基因拷貝數(shù)減少了18.15%～53.33%，土壤中芽孢桿菌數(shù)量增加了45.63%～255.00%，同時增加了土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量，但是減少了真菌數(shù)量。輔以多粘類芽孢桿菌的豬糞堆肥提取液處理增加了Bacillus niabensis和B. aryabhttai的豐富度和細(xì)菌遺傳多樣性，但降低了真菌的豐富度和遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞：多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；堆肥提取液；浸提工藝；遺傳多樣性

中圖分類號：Q938.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0634-06

堆肥提取液是一個豐富的微生物資源庫，含有大量的各種微生物，具有潛在的促生及生防作用[1]。堆肥提取液的生防效果與堆肥提取液中微生物的數(shù)量有關(guān)[2-4]。在堆肥提取液中添加拮抗微生物能夠增強作物抗性，以水稻秸稈為原料的堆肥提取液經(jīng)木霉（Trichoderma harzianum）加強后可使得黃秋葵濕腐病（Choanephora cucurbitarum）的發(fā)生率減少85%[5]。在土壤中澆灌好氣提取堆肥提取液和添加拮抗菌的好氣提取堆肥提取液，可使馬鈴薯莖潰瘍?。≧hizoctonia solani Kühn）和瘡痂病減少到18%～33%[6]。堆肥提取液過濾除菌或加熱滅菌后仍還有抑菌作用[7]，說明堆肥提取液的生防效果與微生物產(chǎn)生的抗生物質(zhì)有關(guān)。在堆肥提取液中輔以兼具促生及生防的根際有益微生物將成為未來堆肥提取液生防研究的熱點內(nèi)容之一[8]。但是如何將有益微生物與堆肥提取液進(jìn)行配伍，以最大程度發(fā)揮有益微生物和堆肥提取液的生防促生效果，還有待于進(jìn)一步的研究。

近年來，越來越多的學(xué)者提出從根際微生態(tài)角度綜合研究解決土傳病害的新思路[9]，并認(rèn)為根際微生態(tài)失調(diào)可能是土傳病害發(fā)生的主要原因[10]。由于煙草根際微生態(tài)是煙草-土壤-微生物及其環(huán)境相互作用的特殊系統(tǒng)，因此，協(xié)調(diào)三者關(guān)系應(yīng)該是解決煙草黑脛病連作障礙的關(guān)鍵問題。芽孢桿菌被認(rèn)為是土壤微生物中最具活力的部分之一，也是土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢種群，在土壤的物質(zhì)和能量循環(huán)中發(fā)揮重要作用，尤其是作為生物菌劑在生物防控和促進(jìn)植物生長方面有著重要的應(yīng)用價值[11]。隨著對土傳病害發(fā)生土壤核心或關(guān)鍵微生物種群研究的深入，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在降低土傳真菌病害發(fā)生和調(diào)控病害發(fā)生的根際土壤微生物區(qū)系方面發(fā)揮著重要作用[9]。因此，在煙草黑脛病的生物防控上，應(yīng)堅持減少土壤中黑脛病病原菌的數(shù)量和調(diào)控?zé)煵莺诿劜〔『Πl(fā)生的根際土壤微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)多樣性并重的原則。

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）屬于芽孢桿菌屬，有關(guān)其強化的堆肥提取液對植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響等方面的研究尚不多見。因此，本研究以腐熟的豬糞堆肥為原料，建立多粘芽孢桿菌與豬糞堆肥提取液的配伍技術(shù)工藝，并研究其對煙草黑脛病土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為堆肥提取液的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬糞堆肥由鄂州市廣豐有機肥有限公司提供，有機質(zhì)39.55%，全氮2.59%，全磷7.94%和全鉀1.37%。芽孢桿菌為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所實驗室篩選的多粘類芽孢桿菌ZWYY-5?？緹熎贩N為云煙87。供試土壤為連續(xù)種植煙草且黑脛病嚴(yán)重發(fā)生，土壤基本理化性質(zhì)為pH 6.65，有機質(zhì)17.50 g/kg，堿解氮108.30 g/kg，速效磷33.88 g/kg，速效鉀149.76 g/kg。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 輔以多粘芽孢桿菌的堆肥提取液工藝 工藝1：選用NB培養(yǎng)基，培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌48 h后計數(shù)，離心濃縮至數(shù)量達(dá)到108～109 CFU/mL，定容到200 mL。將200 mL菌液加到1 kg堆肥中，并調(diào)節(jié)水分含量，分別發(fā)酵24、36、48、72、96 h，于4 ℃保存。將25 g發(fā)酵好的上述堆肥（發(fā)酵不同天數(shù)）加入到500 mL容量瓶中，再加入200 mL自來水，即水∶堆肥8∶1（質(zhì)量比），浸提48 h，浸提完成后分別經(jīng)雙層紗布過濾，于4 ℃保存。

工藝2：將25 g堆肥加入到500 mL容量瓶中，再加入200 mL自來水，浸提48 h，浸提完成后分別經(jīng)雙層紗布過濾，4 ℃保存。選用NB培養(yǎng)基，培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌48 h后計數(shù)，離心濃縮至拮抗菌數(shù)量達(dá)到108～109，定容到200 mL。吸取拮抗菌菌液20 mL，加入到180 mL的堆肥提取液中，分別浸提12、24、36、48、60、72 h，于4 ℃保存。

1.2.2 盆栽試驗 于2014年湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所溫室中進(jìn)行。試驗設(shè)置4個處理，①清水對照（CK）；②多粘類芽孢桿菌菌懸液（B）；③豬糞堆肥提取液（CT）；④輔以多粘類芽孢桿菌的豬糞堆肥提取液（B+CT）。每盆裝有1 kg煙草黑脛病連作土，每處理重復(fù)10次。每盆加10 g復(fù)合肥（10-10-20）與土壤混勻。土壤中病原菌數(shù)量達(dá)到3.45×104 CFU/g干土。當(dāng)煙苗兩葉一心時移栽，常規(guī)水分管理。移栽時每盆澆灌100 mL菌液、堆肥提取液和輔以多粘類芽孢桿菌的堆肥提取液，此后每隔7 d澆灌一次，試驗持續(xù)45 d。分別于15、30、45 d采集根際土壤樣品。

1.3 測定方法

微生物區(qū)系采用連續(xù)稀釋培養(yǎng)法，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基，真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基。煙草黑脛病病原菌疫霉的熒光定量方法參考潘明森等[12]方法。芽孢桿菌則采用LB培養(yǎng)基，涂布前將稀釋液于80 ℃水浴15 min。將每克干土形成的菌落數(shù)（CFU）取對數(shù)值，以lg（CFU/g干土）表示。

土壤DNA提取采用土壤基因組DNA提取試劑盒（MP bio公司）。PCR擴增采用16S rDNA引物Eub338：5′-GC clamp-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

-3′，Eub518：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，其中，GC clamp為5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGC

CCGCCGC-CCCCGCCCC-3′。PCR擴增參考鐘書堂等[13]方法。電泳結(jié)束后銀染膠片并掃描保存，分析DGGE膠片上消失與增加條帶及一些共有條帶的強度差異，切割回收特異條帶并測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

DGGE電泳圖譜采用Quantity One 4.4.0軟件進(jìn)行條帶檢測和強度分析。非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行集群分析。豐度即為DGGE條帶數(shù)。Shannon多樣性指數(shù)（H）計算公式為：

H=-∑PilnPi，式中，Pi=Ni/N。Pi為特異性個體群落數(shù)占總?cè)郝鋽?shù)的比例，Ni為個體條帶強度，N為測出的所有條帶強度總和。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Excel 2003和SPSS 13.0軟件，通過Duncan法檢驗處理間差異的顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔以多粘類芽孢桿菌堆肥提取液的工藝研究

由表1可知，隨著堆置時間的延長，提取液中細(xì)菌、芽孢桿菌和放線菌數(shù)量均呈現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢。對于細(xì)菌而言，堆置72 h處理分別比堆置24、36、48、96 h細(xì)菌增加了2.03倍、92.10%、43.53%和1.42倍，且差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。堆置72 h處理芽孢桿菌數(shù)量分別比堆置24、36、48、96 h增加了1.19倍、51.19%、29.66%和23.63%。堆置72 h處理放線菌數(shù)量分別比堆置24、36、48、96 h增加了69.46%、60.56%、35.57%和35.57%。堆置72 h處理真菌數(shù)量分別比堆置24、36、48、96 h減少了21.79%、24.63%、26.75%和20.61%，但處理間差異不顯著。

由表2可知，浸提24 h堆肥提取液中細(xì)菌數(shù)量最低，分別比浸提12、36、48、60、72 h減少了26.48%、18.14%、14.21%、11.70%和42.29%。對于芽孢桿菌數(shù)量而言，浸提48 h最高，分別比12、24、36、60、72 h增加了1.99、1.22倍、55.12%、36.96%和52.63%，且差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。浸提60 h堆肥提取液中放線菌數(shù)量最高，分別比12、24、36、48、72 h增加了45.95%、16.56%、22.73%、11.73%和43.35%，但處理間差異不顯著。對于真菌數(shù)量而言，浸提48 h最高，分別比12、24、36、60、72 h增加了47.33%、13.01%、0.60%、24.07%和19.57%。

由表3可知，隨著堆置時間的延長，添加堆肥提取液后，黑脛病病原菌的菌落直徑都為0，抑制效果均為100%。但未添加多粘類芽孢桿菌的堆肥提取液，經(jīng)過過濾除菌后喪失了抑菌效果。同樣，先在堆肥中添加多粘類芽孢桿菌后浸提，浸提時間的長短對于抑菌效果亦無影響。

2.2 輔以多粘類芽孢桿菌堆肥提取液對土壤微生物區(qū)系的影響

圖1a表示不同處理對土壤黑脛病病原菌ITS基因拷貝數(shù)的影響。由圖1a可知，移栽后15 d，B、CT和B+CT處理黑脛病病原菌ITS拷貝數(shù)分別比CK減少了10.98%、19.51%和33.33%，但處理間差異不顯著；然而移栽后30 d，B、CT和B+CT處理黑脛病病原菌ITS拷貝數(shù)分別比CK減少了12.28%、14.21%和18.15%，處理與CK之間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）；移栽后45 d，B、CT和B+CT處理黑脛病病原菌ITS拷貝數(shù)分別比CK減少了30.00%、41.67%和53.33%，且B+CT與CK處理間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

圖1b表示不同處理對土壤芽孢桿菌數(shù)量的影響。由圖1b可知，移栽后15 d，B、CT和B+CT處理芽孢桿菌數(shù)量分別比CK增加了8.13%、1.88%和45.63%，但處理間差異不顯著。在移栽后30 d，B、CT和B+CT處理芽孢桿菌數(shù)量分別比CK增加了1.99、1.61、2.36倍，各處理與CK之間、CT與B+CT處理之間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。在移栽后45 d，B、CT和B+CT處理芽孢桿菌數(shù)量分別比CK增加了32.26%、53.76%和2.55倍，且B+CT處理與CK及B、CT處理間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

由表4可知，在移栽后15 d，B、CT和B+CT處理細(xì)菌數(shù)量分別比CK增加了20.66%、29.57%和52.96%，而在30 d和45 d，B、CT、B+CT處理細(xì)菌數(shù)量分別比CK增加了23.18%和2.44%、28.75%和68.50%、69.99%和1.14倍，且CK與B+CT處理間差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。對于放線菌而言，CT和B+CT處理移栽后15 d放線菌數(shù)量分別比CK增加了3.52%和8.03%。而在30 d和45 d，B、CT、B+CT處理放線菌數(shù)量分別比CK增加了6.15%和3.47%、7.23%和18.90%、13.98%和69.05%，且CK與B+CT處理間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。對于真菌數(shù)量而言，在移栽后15 d，B、CT和B+CT處理分別比CK減少了9.96%、7.88%和12.14%，B、CT、B+CT處理移栽后30 d和45 d分別比CK減少了20.59%和9.56%、13.52%和6.98%、37.06%和12.57%，且CK與B+CT處理間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

2.3 輔以多粘類芽孢桿菌堆肥提取液對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知，不同處理間細(xì)菌DGGE條帶差異較?。▓D2A），而真菌條帶略有差異（圖2B）。對于細(xì)菌豐富度而言（表5），B+CT處理最高，分別比CK、B和CT處理增加了1、1和2，且與CT處理間差異達(dá)到顯著水平。B+CT處理Shannon指數(shù)分別比CK、B和CT處理增加了0.06、0.05和0.04；對于真菌豐富度而言，B+CT處理分別比CK、CT處理減少了1和3，但比B處理增加了5，且不同處理間差異達(dá)到顯著水平。CT處理Shannon指數(shù)分別比CK、B和B+CT處理增加了0.09、0.27和0.12。

細(xì)菌條帶切膠測序結(jié)果（表6）表明，可能的細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、黃桿菌屬、黃色單胞菌屬和草酸桿菌屬，分別屬于厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門。

真菌條帶切膠測序結(jié)果（表7）表明，可能的真菌屬為曲霉屬、地絲霉屬、糞盤菌屬、支頂孢屬、鐮刀菌屬、甘藍(lán)菌屬和大環(huán)柄菇屬，且主要歸屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門。

3 小結(jié)與討論

3.1 不同提取工藝堆肥提取液微生物數(shù)量及其對病原菌的抑制效果

影響堆肥提取液生防和促生效果的因素包括堆肥生產(chǎn)過程中的影響因素（原料種類、腐熟時間等）、提取過程的影響因素（堆肥與提取液的提取比例、提取過程中是否通氣或攪拌、提取時間、提取溫度、pH等）以及添加的營養(yǎng)物質(zhì)種類和數(shù)量等[1，3，8，14]。研究發(fā)現(xiàn)，堆肥提取液的防控效果與堆肥提取液中微生物的數(shù)量呈正相關(guān)[2，3]；也有研究表明堆肥提取液過濾除菌或加熱滅菌后仍保留抑菌作用[7]，這可能是由于抗生物質(zhì)的存在所致?；诖?，一些研究者對在堆肥提取液中添加外源功能微生物方面進(jìn)行了試驗[15，16]。在本試驗中，不論工藝1還是工藝2，浸提72 h的堆肥提取液細(xì)菌總數(shù)和芽孢桿菌總數(shù)均最高，但是工藝1細(xì)菌和芽孢桿菌的總數(shù)要高于工藝2，這也進(jìn)一步說明了堆肥原料和工藝對堆肥提取液中微生物數(shù)量的影響[4，14，15]。但對于其防治效果而言，兩種工藝制作的堆肥提取液均能完全抑制平板上黑脛病病原菌的生長，而是否添加多粘類芽孢桿菌對堆肥提取液的抑菌效果沒有影響，這說明堆肥提取液中土著微生物的數(shù)量足以抑制病原菌的生長，這與前期的研究結(jié)果一致[1，2]。

3.2 輔以多粘類芽孢桿菌堆肥提取液對黑脛病發(fā)生的土壤群落結(jié)構(gòu)的影響

研究表明，與堆肥提取液相比，經(jīng)過生防菌強化的堆肥提取液具有較高的防病效果[15，17，18]。在本試驗中，與堆肥提取液相比，經(jīng)過多粘類芽孢桿菌強化的堆肥提取液處理土壤中疫霉菌ITS拷貝數(shù)顯著降低，這可能與土壤中芽孢桿菌對疫霉菌的拮抗作用有關(guān)。與對照相比，施用堆肥提取液、菌劑以及輔以芽孢桿菌的堆肥提取液均能增加土壤細(xì)菌和放線菌總數(shù)，但是減少了真菌的數(shù)量。由于堆肥或者堆肥提取液本身就是一個微生物資源庫，添加到土壤中勢必會增加土壤中的微生物數(shù)量[4]。大量的研究表明，將拮抗菌添加到有機肥中制成生物有機肥，再施用到土壤中不僅能夠增加細(xì)菌數(shù)量，還能增加土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性[19，20]。

平板計數(shù)方法僅能反映土壤中可培養(yǎng)微生物種群的數(shù)量變化，無法反映微生物種類的改變。PCR-DGGE被應(yīng)用于研究可培養(yǎng)細(xì)菌群落的變化并探尋影響細(xì)菌群落變化的生物和環(huán)境關(guān)鍵因子[21]。通過PCR-DGGE分析發(fā)現(xiàn)，施用輔以多粘類芽孢桿菌的堆肥提取液增加了土壤細(xì)菌豐富度和遺傳多樣性指數(shù)。付琳等[22]的DGGE結(jié)果表明，施用生物有機肥的香蕉園土壤總細(xì)菌的豐富度及多樣性明顯提高。雖然兩者施用的有機肥狀態(tài)（液體和固體）不同，但兩者的結(jié)果相似。細(xì)菌DGGE部分條帶切膠回收測序分析表明，4種處理土壤中細(xì)菌主要以厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門為主，不同處理間種類差異較小，但是輔以多粘類芽孢桿菌的豬糞堆肥提取液有增加土壤中Bacillus niabensis和B. aryabhttai豐富度的趨勢。真菌DGGE部分條帶切膠回收測序分析表明，單施菌劑減少了曲霉屬、糞盤菌屬、支頂孢屬、鐮刀菌屬、甘藍(lán)菌屬和大環(huán)柄菇屬的豐富度。此外，在CK和CT處理中均發(fā)現(xiàn)有鐮刀菌屬菌種存在，但是在B和B+CT處理中則不存在，這可能是由于多粘類芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種拮抗物質(zhì)并能抑制尖孢鐮刀菌的生長所致[13]。施用菌劑和堆肥提取液減少了曲霉屬和新縫匠菌的豐富度。

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