陳晶　秦嶸嶸　陳少健

[摘要]目的 研究纈沙坦對兔耳增生性瘢痕形成的影響。方法16只新西蘭兔隨機(jī)分為4組，每只兔耳腹側(cè)制作6個(gè)創(chuàng)面。高劑量治療組：術(shù)后第21天開始給予纈沙坦8mg/（kg·d）口服治療。低劑量治療組：在術(shù)后第21天開始予纈沙坦4mg/（kg·d）口服治療。陽性對照組：分別在術(shù)后第21天和28天時(shí)給予皮損內(nèi)曲安奈德注射治療。陰性對照組：不給于任何干預(yù)。在術(shù)后第42天時(shí)處死所有兔子，收集所有標(biāo)本行蘇木素-伊紅染色和苦味酸天狼星紅染色。結(jié)果高劑量治療組的瘢痕增生指數(shù)（1.71±0.11）、成纖維細(xì)胞數(shù)量（438.15±50.01）、I型膠原百分比（41.94±2.29）、Ⅲ型膠原百分比（28.83±1.48）均低于陰性對照組（2.02±0.29），（612.08±106.59），（49.51±2.81），（29.80±1.39）；低劑量治療組的I型及Ⅲ型膠原百分比（48.24±2.02），（29.05±1.10）均低于陰性對照組；陽性對照組的瘢痕增生指數(shù)（1.33±0.13）、成纖維細(xì)胞數(shù)量（233.08±62.32）、I型及Ⅲ型膠原百分比（36.42±2.41），（27.94±2.26）均低于高劑量治療組。結(jié)論纈沙坦可以在一定程度上抑制兔耳瘢痕增生，高劑量治療效果更佳。

[關(guān)鍵詞]纈沙坦；曲安奈德；增生性瘢痕；兔耳瘢痕模型

皮膚病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其形成及發(fā)展與遺傳、治療等諸多方面有著密切的聯(lián)系，但主要的特征為成纖維細(xì)胞的過度增生和膠原蛋白代償失調(diào)導(dǎo)致的異常堆積。由于其病因尚不清楚，目前臨床上常使用的治療方法（手術(shù)、藥物、機(jī)械壓迫、放射等）都無法完全令人滿意。因此，其發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)的研究熱度經(jīng)久不衰。腎素一血管緊張素系統(tǒng)在各臟器纖維化過程中發(fā)揮重要作用，通過細(xì)胞培養(yǎng)研究，人們發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ的1型受體（ATlR）拈抗劑氯沙坦能夠抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的生長增殖及纖維鏈接蛋白的合成，提示ATlR拮抗劑可能對增生性瘢痕有防治作用。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察ATlR拮抗劑（纈沙坦）對增生性瘢痕的影響。

1.材料與方法

1.1材料

動(dòng)物：16只新西蘭兔（雌性，2000～2500g，清潔級，分籠飼養(yǎng)），購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已通過汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。儀器：Leica DMRXA2全能顯微鏡（德國Leica公司），Leica RM2235手動(dòng)轉(zhuǎn)輪切片機(jī)（德國Leica公司），CS-VI型攤片、烤片機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），Leica IM50圖像采集系統(tǒng)（德國Leica公司），圖像分析系統(tǒng)為Image-ProPlus（Media Cybernetics L.P.），偏振光顯微鏡（DMR顯微鏡，Leica）。藥物：纈沙坦膠囊（北京諾華制藥.有限公司），曲安奈得注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）。

1.2方法

使用戊巴比妥鈉（1.5mg/kg）靜脈麻醉新西蘭兔，將兔耳腹側(cè)展平后測量、描繪直徑1cm圓形手術(shù)區(qū)域，每個(gè)手術(shù)區(qū)域間隔約1cm。使用10號手術(shù)刀片切開全層皮膚及軟骨膜達(dá)軟骨，蚊式血管鉗沿創(chuàng)緣小心剝離全層皮膚及軟骨膜。每只兔耳制備6個(gè)圓形缺損面，共192處，術(shù)后創(chuàng)面暴露，待其自行愈合。

1.3動(dòng)物分組

按照隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法分為4組，每組4只。高劑量治療組：術(shù)后第21天開始予纈沙坦8mg/（kg·d）混懸液（溶劑為滅菌注射用水）灌胃，每天1次；低劑量治療組：術(shù)后第21天開始予纈沙坦4mg/（kg·d）混懸液（溶劑為滅菌注射用水）灌胃，每天1次；陽性對照組：術(shù)后第21天和28天分別進(jìn)行曲安奈德溶液0.1mL皮損內(nèi)注射；陰性對照組：不給于任何干預(yù)。

1.4取材及標(biāo)本制作

術(shù)后第42天，使用戊巴比妥鈉（1.5mg/kg）靜脈麻醉新西蘭兔，切取所有創(chuàng)面標(biāo)本（直徑約1.2cm，圓形），每個(gè)標(biāo)本沿正中線平均分為2份。標(biāo)本置于10%甲醛溶液中固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片（厚度5um）后，進(jìn)行HE染色和苦昧酸天狼星紅染色。

1.5觀察指標(biāo)

（1）大體觀察：術(shù)后第42天拍照記錄創(chuàng)面情況，觀察瘢痕的高度、顏色、質(zhì)地。鏡下觀察：膠原纖維的排列、形態(tài)。（2）瘢痕增生指數(shù)，用測微尺測量兔耳瘢痕最高點(diǎn)至耳軟骨表面的垂直厚度（a）、瘢痕周邊正常皮膚至耳軟骨表面的垂直厚度（b），計(jì)算得出瘢痕增生指數(shù)（HI=a/b）。（3）成纖維細(xì)胞數(shù)量：經(jīng)蘇木精一伊紅染色制成瘢痕組織切片，按Weidner計(jì)數(shù)方法在400倍視野光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野的成纖維細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)視野由2位醫(yī)師同時(shí)計(jì)數(shù)，求其平均值。（4）I、Ⅲ型膠原百分比：苦味酸天狼星紅染色切片，在100倍偏振光顯微鏡下每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野，采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)分別進(jìn)行檢測。I型膠原百分比=（紅色區(qū)域面積+黃色區(qū)域面積）/總面積×100%；Ⅲ型膠原百分比=綠色區(qū)域面積/總面積×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（x±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1大體觀察

陽性對照組：瘢痕平坦，顏色最淺，質(zhì)地最軟。高劑量治療組：瘢痕較平，顏色略紅，質(zhì)地較軟。低劑量治療組和陰性對照組：瘢痕明顯隆起，顏色較深，質(zhì)地堅(jiān)硬。

2.2鏡下觀察

陽性對照組：膠原纖維排列整齊，形態(tài)纖細(xì)。高劑量治療組：膠原纖維排列欠整齊，形態(tài)較纖細(xì)。低劑量治療組：膠原纖維排列紊亂，形態(tài)較粗。陰性對照組：膠原纖維排列紊亂，形態(tài)粗大。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）瘢痕增生指數(shù)。多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較：高劑量治療組、陽性對照組分別與陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低劑量治療組與陰性對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.15）。（2）成纖維細(xì)胞數(shù)量。多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較：高劑量治療組、陽性對照組分別與陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低劑量治療組與陰性對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.22）。（3）I型膠原百分比（%）。多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較：高劑量治療組、低劑量治療組、陽性對照組分別與陰性對照組較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（4）Ⅲ型膠原百分比（%）。多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較：高劑量治療組分別與陽性對照組、陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高劑量治療組與低劑量治療組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.50）；低劑量治療組分別與陽性對照組、陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見表1。

3.討論

增生性瘢痕是由物理、機(jī)械、化學(xué)、生物等因素引起皮膚組織損傷后，愈合功能失調(diào)的臨床表現(xiàn)，其形成及發(fā)展與遺傳、感染、解剖部位等諸多因素有關(guān)，與之相關(guān)的攣縮、畸形、灼熱感、瘙癢感、毀容等能夠遮掩手術(shù)的成功，并成為患者和醫(yī)生共同關(guān)注的問題。目前研究將其發(fā)病機(jī)制歸納為成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生和沉積。成纖維細(xì)胞是創(chuàng)傷愈合時(shí)的主要修復(fù)細(xì)胞，在病理狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞增殖旺盛并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)中含量最多的是I、Ⅲ型膠原，I型膠原較為粗大在皮膚中主要起支持作用，而Ⅲ型膠原包繞著I型膠原起到連接和物質(zhì)交換等作用，正常瘢痕組織以I型膠原增加為主，在增生性瘢痕中I、Ⅲ型膠原均明顯增加。兔耳瘢痕模型制取方便易行，且在增生性瘢痕形成過程中膠原的含量及比例與人增生性瘢痕極為相似，是研究瘢痕中膠原表達(dá)變化較為理想的動(dòng)物模型。目前，增生性瘢痕的治療方法眾多，但都無法達(dá)到令人滿意的治療效果，在判定其他治療方法的療效時(shí)，皮損內(nèi)類固醇注射治療被作為標(biāo)準(zhǔn)。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性成分是血管緊張素Ⅱ，在促進(jìn)心臟、腎臟、肝臟等器官的纖維化過程中發(fā)揮重要作用。皮膚組織具有獨(dú)立合成血管緊張素Ⅱ的能力；在增生活躍的增生性瘢痕組織中血管緊張素Ⅱ表達(dá)增加，并通過血管緊張素Ⅱ的1型受體（ATlR）和2型受體（AT2R）及其下游信號通路來發(fā)揮病理生理作用，刺激ATlR可以促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖及合成I型膠原纖維和轉(zhuǎn)化生長因子B1，刺激AT2R促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞凋亡，并抑制膠原合成，促進(jìn)膠原降解。纈沙坦是選擇性ATlR受體阻滯劑，通過肝纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，其可下調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞活化；并可下調(diào)I型膠原及轉(zhuǎn)化生長因子B1的表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化的作用。與其他ATlR受體阻滯劑相比，纈沙坦幾乎不經(jīng)過代謝，以原形排泄，臨床沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)藥物在誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞色素P450系統(tǒng)方面與之發(fā)生相互影響。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷形成后口服高劑量纈沙坦，對兔耳增生性瘢痕的瘢痕增生指數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)量、I和Ⅲ型膠原百分比均有較明顯抑制作用，說明纈沙坦具有抑制兔耳瘢痕增生的作用。低劑量治療組的I和Ⅲ型膠原百分比雖有下降，但對大體形態(tài)的影響并不顯著，表明纈沙坦對兔耳增生性瘢痕的抑制作用可能存在劑量依賴性。關(guān)于糖尿病腎病的臨床研究表明，雙倍劑量的纈沙坦可以顯著抑制或逆轉(zhuǎn)間質(zhì)纖維化、提高療效、減少復(fù)發(fā)，而且不良反應(yīng)無明顯增加。以上結(jié)果提示我們，應(yīng)用纈沙坦治療增生性瘢痕時(shí)應(yīng)使用高劑量，而增加藥物劑量后的治療風(fēng)險(xiǎn)需進(jìn)一步研究和評估。此外，口服纈沙坦對增生性瘢痕的抑制作用不及皮損內(nèi)糖皮質(zhì)激素注射治療，而且無法使瘢痕完全消退，在治療增生性瘢痕時(shí)仍無法獲得理想效果，存在一定局限性。但在糖皮質(zhì)激素應(yīng)用禁忌時(shí)，可以考慮口服纈沙坦作為替代治療。

綜上所述，高劑量纈沙坦通過抑制成纖維細(xì)胞增殖及I和Ⅲ型膠原沉積，可以在一定程度上抑制兔耳瘢痕增生，但是其具體機(jī)制、藥效劑量關(guān)系及聯(lián)合用藥效果有待進(jìn)一步研究。