栗振凱，李中秋，孟麗雅，張佳彤，張 巧

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)醫(yī)院疾病預(yù)防控制科 鄭州 450001

肺癌發(fā)病隱匿，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[1-2]，是最危險(xiǎn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居全球之首，每年約有120萬(wàn)人死于肺癌，5 a生存率仍然很低[3]。苯并(a)芘[benzo(a)pyrene，B(a)P]是一種多環(huán)芳香烴類化合物，其代謝活化產(chǎn)物是毒性最大的強(qiáng)致癌物，是一種持久性的有機(jī)污染物，普遍存在于汽車尾氣、煤、石油等產(chǎn)生的煙和化工產(chǎn)品中，目前已有大量實(shí)驗(yàn)[4-5]證明B(a)P與肺癌關(guān)系密切，但是其致癌機(jī)制尚不明確。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22nt的非編碼RNA，它通過(guò)與mRNA結(jié)合發(fā)揮分子功能，包括促進(jìn)mRNA的降解或增強(qiáng)其翻譯過(guò)程、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控編碼基因[6-7]等。研究[8-9]表明，miRNA具有很多生物學(xué)功能，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。本研究構(gòu)建染毒B(a)P的永生化人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)模型，通過(guò)芯片技術(shù)檢測(cè)染毒和未染毒細(xì)胞的miRNA和mRNA表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)miRNA和mRNA，從而為進(jìn)一步研究miRNA與肺癌之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器BEAS-2B細(xì)胞由本課題組留存。B(a)P購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用DMSO溶解制成2.5 g/L的母液待用。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMSO和胰蛋白酶均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gemini公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；4×gDNA wiper Mix、RNA模板，5×HiscriptRⅡRT SuperMix Ⅱ，AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Low ROX Premixed)購(gòu)自南京諾唯贊生物有限公司。mRNA分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Epicentre公司；SureHyb購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；miRCRYTMArray Labeling試劑盒、CIP緩沖劑、CIP酶、免疫熒光雙標(biāo)和酶標(biāo)記物購(gòu)自美國(guó)Exiqon公司；RNA Flash Labeling 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Arraystar公司；7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems 公司。

1.2 惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞模型的構(gòu)建及鑒定取10 μL的B(a)P母液與5 mL培養(yǎng)基混勻，使B(a)P濃度為5 mg/L[10]。BEAS-2B細(xì)胞用含B(a)P培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去含B(a)P培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化、常規(guī)傳代；當(dāng)細(xì)胞再次融合至約70%時(shí)，再次加入含B(a)P培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h、傳代。反復(fù)染毒3次的細(xì)胞確定為第一代染毒細(xì)胞。未染毒細(xì)胞用同體積DMSO培養(yǎng)，方法同前。取傳至30代后的細(xì)胞檢測(cè)克隆形成能力、遷移能力和增殖活性。

①克隆形成能力：采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，200個(gè)/孔接種于6孔板，加入3 mL RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，5 d換液一次，培養(yǎng)2周。終止培養(yǎng)后棄上清，PBS清洗，甲醇固定20 min，吉薩姆染色10 min，干燥。鏡下計(jì)數(shù)多于 50 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

②遷移能力：采用劃痕實(shí)驗(yàn)。用記號(hào)筆在6孔板背面畫5條間隔相等的橫線。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，1×106個(gè)/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用槍頭垂直于橫線劃痕，PBS清洗，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。于培養(yǎng)6、12、24、48 h后鏡下觀察并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析劃痕間距，記錄遷移距離。

③增殖活性：采用MTT實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，5 000個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12、24、36和48 h后，避光加入5 g/L MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h,棄上清，加入150 μL DMSO,搖床振蕩10 min,置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)490 nm處吸光度值。

1.3 差異表達(dá)miRNA的篩選用Trizol法提取染毒和未染毒細(xì)胞中的總RNA，用miRCRYTMArray Labeling試劑盒標(biāo)記miRNA：將1 μg總RNA 樣品和1 μL CIP緩沖劑和CIP酶加入到 2 μL水中，混合均勻后，37 ℃放置30 min，95 ℃放置5 min。再加入3 μL標(biāo)記緩沖液、1.5 μL免疫熒光雙標(biāo)和2.0 μL的酶標(biāo)記物，混合均勻后16 ℃孵育1 h，65 ℃孵育15 min。取25 μL樣品和25 μL雜交緩沖液混勻并于95 ℃變性2 min，冰上靜置2 min。將樣品置于芯片上，56 ℃反應(yīng)16～20 h。用清洗液洗滌芯片，用生物芯片掃描儀掃描，對(duì)芯片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析。以變化倍數(shù)(FC)≥2.0且P<0.05 為差異表達(dá)miRNA。

1.4 差異表達(dá)mRNA的篩選用Trizol法分別提取染毒和未染毒細(xì)胞中的總RNA。采用mRNA分離試劑盒去除tRNA，用RNA Flash Labeling試劑盒標(biāo)記mRNA，使用SureHyb進(jìn)行雜交。芯片洗滌固定后，再進(jìn)行掃描雜交。使用GeneSpring軟件對(duì)芯片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以FC≥2.0且P<0.05 為差異表達(dá)mRNA。對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.5 細(xì)胞中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表達(dá)的檢測(cè)染毒和未染毒細(xì)胞融合至90%時(shí)，分別提取總RNA，加入2 μL的4×gDNA wiper Mix，2 μL的RNA模板混勻，42 ℃孵育2 min。加5×HiscriptRⅡRT SuperMix Ⅱ混勻；25 ℃孵育10 min，50 ℃孵育30 min，85 ℃孵育5 min；反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL cDNA加入10 μL的AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Low ROX Premixed)、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL和7.2 μL無(wú)酶水。擴(kuò)增過(guò)程：95 ℃5 min預(yù)變性；95 ℃10 s,60 ℃30 s,40個(gè)循環(huán)；融解95 ℃15 s,60 ℃60 s,95 ℃15 s。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次。引物由南京諾唯贊基因組研究中心有限公司合成，序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，染毒和未染毒細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞模型的鑒定染毒、未染毒組平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，克隆形成率分別為(23.444±0.727)%、(0.889±0.601)%，染毒組大于未染毒組(t=41.420,P<0.001)。染毒組細(xì)胞增殖活性、遷移能力均強(qiáng)于未染毒組(圖2、3)，提示染毒組細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

圖1 未染毒(A)和染毒(B)組細(xì)胞克隆形成情況

圖2 未染毒和染毒組細(xì)胞增殖活性比較(*：P<0.05)

圖3 未染毒和染毒組細(xì)胞遷移距離比較(*：P<0.05)

2.2 差異表達(dá)mRNA與miRNA的篩選芯片表達(dá)譜見圖4。聚類分析結(jié)果顯示，染毒組和未染毒組細(xì)胞在不同的簇中，說(shuō)明B(a)P染毒改變了細(xì)胞功能。共篩選出127種差異表達(dá)miRNA，其中29種表達(dá)上調(diào)，98種表達(dá)下調(diào)，前20位表達(dá)差異的miRNA見表2。共篩選出159種差異表達(dá)mRNA,其中99種表達(dá)上調(diào)，60種表達(dá)下調(diào)，前20位表達(dá)差異的mRNA見表3。

圖4 染毒和未染毒組細(xì)胞miRNA(左)和mRNA(右)的芯片表達(dá)譜

表2 前20位差異表達(dá)miRNA

表3 前20位差異表達(dá)mRNA

2.3 差異表達(dá)mRNA的GO和KEGG分析結(jié)果GO分析結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)的差異表達(dá)mRNA主要涉及的生物學(xué)過(guò)程有組織器官生長(zhǎng)發(fā)育、維持細(xì)胞金屬離子穩(wěn)態(tài)和免疫應(yīng)答等，涉及的細(xì)胞組分主要有反式高爾基體管網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分選和轉(zhuǎn)運(yùn)、MHC蛋白復(fù)合體、MHC 基因家族Ⅰ蛋白等，涉及的分子功能主要有抗原結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體活化等。表達(dá)下調(diào)的差異表達(dá)mRNA主要涉及的生物學(xué)過(guò)程有P38MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)、正向調(diào)控細(xì)胞凋亡、負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄等，涉及的細(xì)胞組分主要有胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器構(gòu)成細(xì)胞獨(dú)立的結(jié)構(gòu)及功能、轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物、通過(guò)膜結(jié)構(gòu)相互協(xié)作等，涉及的分子功能主要有跨膜受體蛋白酶活性、雙鏈DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄因子等。

KEGG分析結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)的差異表達(dá)mRNA可能參與了細(xì)胞活素-受體相互作用介導(dǎo)的信號(hào)通路和Jas-STAT介導(dǎo)的信號(hào)通路，并且參與Toll樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，通過(guò)TLR9來(lái)活化NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1，釋放TNF-α因子從而發(fā)揮免疫監(jiān)視功能；表達(dá)下調(diào)的mRNA可能參與了p53信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、周期阻滯和腫瘤血管抑制，TGF-β介導(dǎo)的抑制細(xì)胞分裂和Gadd45介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)等。

2.4 兩組細(xì)胞中hsa-miR-2115-3p 和hsa-miR-4521表達(dá)的比較針對(duì)miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果，選取hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521進(jìn)行驗(yàn)證。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，染毒組細(xì)胞hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表達(dá)水平均低于未染毒組。

表6 兩組細(xì)胞中兩種miRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

B(a)P常常存在于汽車尾氣及化學(xué)制品中，是主要的大氣污染物之一，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC評(píng)為一級(jí)致癌物[11-12]。細(xì)胞模型是研究癌癥的重要手段。本研究用B(a)P對(duì)BEAS-2B染毒后，細(xì)胞克隆形成能力、遷移能力和增殖活性均明顯增強(qiáng)，提示成功構(gòu)建了B(a)P誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型。

miRNA是非編碼蛋白的小RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)抑制翻譯或降解靶mRNA,調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性[13]。miRNA通過(guò)影響不同的mRNA參與細(xì)胞癌變的生物學(xué)過(guò)程[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)抑制miR-223-3p表達(dá)可以抑制JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞周期進(jìn)展。Giordano等[16]以50歲為界限將88名肺腺癌患者分為兩組，發(fā)現(xiàn)7種差異表達(dá)miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)，B(a)P染毒和未染毒的BEAS-2B有159種差異表達(dá)mRNA,其中99種表達(dá)上調(diào)，60種表達(dá)下調(diào)；有127種差異表達(dá)miRNA，其中29種表達(dá)上調(diào)，98種表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)mRNA的GO分析結(jié)果顯示：表達(dá)上調(diào)的mRNA分子功能主要富集于受體活化、抗原結(jié)合和細(xì)胞因子受體結(jié)合等；細(xì)胞組分主要富集于蛋白質(zhì)分類轉(zhuǎn)運(yùn)、MHC蛋白復(fù)合體與抗原呈遞過(guò)程等；生物學(xué)過(guò)程主要富集于促進(jìn)器官生長(zhǎng)、免疫應(yīng)答和維持金屬離子在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)等。表達(dá)下調(diào)的mRNA分子功能主要富集于影響跨膜受體蛋白酶活性、轉(zhuǎn)錄因子和雙鏈DNA結(jié)合等；細(xì)胞組分主要富集于胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器構(gòu)成細(xì)胞獨(dú)立的結(jié)構(gòu)及功能；生物學(xué)過(guò)程主要富集于調(diào)控P38MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡。KEGG分析結(jié)果顯示：表達(dá)上調(diào)的mRNA可能參與了細(xì)胞活素-受體相互作用介導(dǎo)的信號(hào)通路等；表達(dá)下調(diào)的mRNA可能參與了p53信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、周期阻滯和腫瘤血管抑制等。本研究對(duì)染毒和未染毒細(xì)胞中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果染毒組均低于未染毒組，與芯片分析結(jié)果一致。

基因組不穩(wěn)定性和突變是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞的基礎(chǔ)[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)上調(diào)反式-7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并芘誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞中miR-542-3p表達(dá)水平，可降低細(xì)胞的增殖能力和惡性程度。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)mRNA參與了脂肪積聚肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程[19]。本研究發(fā)現(xiàn)B(a)P誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的BEAS-2B中miRNA及mRNA表達(dá)譜發(fā)生顯著改變,差異表達(dá)miRNA及mRNA可能參與了細(xì)胞的惡變過(guò)程；發(fā)現(xiàn)的與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的mRNA和miRNA將有助于發(fā)現(xiàn)新型分子標(biāo)志或靶點(diǎn)，為B(a)P誘導(dǎo)肺癌的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。