司 瑋，張芬芬，王春梅，劉素素，岳 娟，簡守珺，張紅敏

1)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院眼科；河南省立眼科醫(yī)院；河南省眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450003 2)德州市人民醫(yī)院眼科 山東 德州 253003

真菌性角膜炎是一種臨床上常見的致盲性、真菌感染性眼病，是我國角膜移植的主要原因[1-3]。真菌性角膜炎免疫反應(yīng)過程中，中性粒細(xì)胞發(fā)揮著關(guān)鍵的抗真菌作用[4-6]。我們前期的研究顯示，血小板圍繞真菌性角膜炎小鼠模型真菌感染病灶形成血小板浸潤帶；腹腔注射血小板中和抗體去除血小板后，真菌性角膜炎感染嚴(yán)重，菌絲量大，角膜臨床癥狀加重；提示血小板參與了角膜的抗真菌感染過程(未發(fā)表資料)。近來許多研究[7-10]表明，血小板除了在血栓形成和止血中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能外，在免疫防御方面也發(fā)揮著重要作用。我們采用中性粒細(xì)胞、血小板和真菌體外共培養(yǎng)的方法，觀察血小板的體外抗真菌作用，為真菌性角膜炎的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液、紅細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；EDTA-K2抗凝管(湖南三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司)；Percoll分離液(美國GE Healthcare公司)；瑞姬氏染液(南京建成科技有限公司)；鈣熒光白(美國Fluka公司)；抗人CD41a-PE、抗人CD15-FITC、FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)、真菌生化培養(yǎng)箱(中國廣東省醫(yī)療器械廠)、離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)、微量移液器(法國Gilson公司)、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡(英國Andor公司)。

1.2 真菌菌株來源及真菌孢子的提取腐皮鐮胞菌標(biāo)準(zhǔn)株，編號3.5840，購自中國科學(xué)院微生物研究所，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)。參考文獻(xiàn)[11]方法，選取培養(yǎng)4～7 d、狀態(tài)良好的菌株用于實(shí)驗(yàn)。于培養(yǎng)真菌菌株的玻璃試管中，加入2～3 mL無菌RPMI 1640培養(yǎng)液，用無菌吸管輕輕從瓊脂斜面刮取真菌菌落，吹打混勻，使真菌菌絲和孢子懸浮，用對折兩次的無菌紗布將真菌混懸液過濾，濾除菌絲，將包含孢子的濾液收集至無菌離心管中并300×g離心5 min，收集孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡下計(jì)數(shù)孢子數(shù)目，置于冰盒中備用。

1.3 人外周血血小板和中性粒細(xì)胞的分離

1.3.1人外周血來源 健康志愿者入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～35歲；15 d內(nèi)無感染性疾病發(fā)生，3個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用抗生素；無全身性疾病；6個(gè)月內(nèi)無獻(xiàn)血史。排除妊娠和生理期女性。本研究通過河南省立眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審批，批準(zhǔn)號：HNEECKY-2018(1)。單次采集健康志愿者外周靜脈全血15 mL至EDTA-K2抗凝管中，顛倒混勻后300×g離心10 min。上層為富血小板血漿層，下層為細(xì)胞層。

1.3.2血小板的分離 參考文獻(xiàn)[11]方法，全血離心后，吸取上層富血小板血漿于新離心管中600×g離心10 min，白色沉淀即為血小板。取2 μL血小板沉淀均勻涂布于載玻片上，用瑞姬氏染液染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行純度計(jì)數(shù)，選取純度大于95%的血小板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取血小板,加入1 mL培養(yǎng)基輕輕重懸，制成均勻的血小板懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，置于常溫備用。

1.3.3中性粒細(xì)胞的分離 全血離心后，收集下層細(xì)胞層至離心管內(nèi)，加入細(xì)胞層3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻，冰盒中避光裂解10～12 min，300×g離心5 min，白色沉淀即為白細(xì)胞層。使用Percoll梯度離心法600×g離心20 min得到中性粒細(xì)胞[12]。經(jīng)純度鑒定后制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，方法同1.3.2，置于常溫備用。

1.4 中性粒細(xì)胞吞噬率測定實(shí)驗(yàn)分為孢子(S)+中性粒細(xì)胞(N)組和S+N+血小板(PL)組。預(yù)先分別用體積分?jǐn)?shù)0.2%鈣熒光白(藍(lán)色)、抗人CD15-FITC(綠色)和抗人CD41a-PE(紅色)標(biāo)記孢子、中性粒細(xì)胞和血小板。將中性粒細(xì)胞均勻接種于12孔板中，每孔5×105個(gè)，每組接種2孔。S+N組按照孢子∶中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)1∶1的比例加入孢子；S+N+PL組按照孢子∶中性粒細(xì)胞∶血小板個(gè)數(shù)1∶1∶20的比例加入孢子和血小板；用RPMI 1640培養(yǎng)液將每孔定容至1.5 mL并將孔板放入轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡活細(xì)胞孵育培養(yǎng)系統(tǒng)(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%濕度)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、4 h后每組選取20倍物鏡下5個(gè)視野拍照。將各通道熒光圖片與光學(xué)圖片融合后，計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的中性粒細(xì)胞總數(shù)、吞噬孢子的中性粒細(xì)胞數(shù)。中性粒細(xì)胞吞噬率=吞噬孢子的中性粒細(xì)胞數(shù)/中性粒細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.5 孢子出芽率和菌絲伸長度測定實(shí)驗(yàn)分為S組、S+N組、S+N+PL組，S∶N∶PL個(gè)數(shù)比例為1∶5∶100。將中性粒細(xì)胞均勻接種于12孔板中，每孔5×105個(gè)，每組接種2孔，余鋪板、染色及計(jì)數(shù)方法同1.4。①分別于培養(yǎng)1、2、4 h后每組選取20倍物鏡下5個(gè)視野拍照。將各通道熒光圖片與光學(xué)圖片融合后，計(jì)數(shù)5個(gè)視野中出芽孢子個(gè)數(shù)及孢子總數(shù)。孢子出芽率=出芽孢子個(gè)數(shù)/孢子總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次。②分別于培養(yǎng)4、6、8 h后，每組選取20倍物鏡下5個(gè)視野拍照，用Imaris 7.2測量視野內(nèi)所有完整真菌菌絲長度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次。

1.6 中性粒細(xì)胞凋亡率測定實(shí)驗(yàn)分為N組、S+N組、S+N+PL組，S∶N∶PL個(gè)數(shù)比例為1∶5∶100。將中性粒細(xì)胞均勻接種于12孔板中，每孔5×105個(gè)，每組接種2孔，培養(yǎng)條件同1.4。分別于培養(yǎng)6、10、14、18 h后，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作檢測凋亡的中性粒細(xì)胞。在相應(yīng)孔內(nèi)加入Annexin V和PI試劑，避光孵育15 min后放置于轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的活細(xì)胞孵育培養(yǎng)系統(tǒng)中，每組在20倍物鏡下選取5個(gè)視野拍照。僅Annexin V著染的為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V與PI雙染的為晚期凋亡細(xì)胞。計(jì)數(shù)5個(gè)視野中熒光著染的中性粒細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞總數(shù)。中性粒細(xì)胞凋亡率=熒光著染的中性粒細(xì)胞數(shù)/中性粒細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間中性粒細(xì)胞吞噬率及凋亡率、孢子出芽率的比較采用單因素方差分析(兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn))或兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；菌絲伸長度為非正態(tài)分布，同一時(shí)間點(diǎn)組間比較均采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 S+N組和S+N+PL組中性粒細(xì)胞吞噬率的比較見圖1、表1。S+N+PL組中性粒細(xì)胞吞噬率大于S+N組。

藍(lán)色：孢子；綠色：中性粒細(xì)胞；紅色：血小板；白色箭頭示中性粒細(xì)胞吞噬真菌孢子圖1 兩組中性粒細(xì)胞吞噬真菌孢子的表現(xiàn)

表1 S+N組和S+N+PL組中性粒細(xì)胞吞噬率的比較 %

2.2 3組孢子出芽率和菌絲伸長度的比較見圖2、3和表2。S+N+PL組孢子出芽率和菌絲伸長度小于S+N組和S組；S+N組孢子出芽率小于S組，6 h時(shí)的菌絲伸長度小于S組。

表2 3組孢子出芽率和菌絲伸長度比較

2.3 3組中性粒細(xì)胞凋亡率的比較見圖4、表3。S+N+L組中性粒細(xì)胞凋亡率小于S+N組和N組。

藍(lán)色：孢子；綠色：中性粒細(xì)胞；紅色：血小板；白色箭頭示孢子出芽圖2 3組孢子出芽的表現(xiàn)

藍(lán)色：孢子；綠色：中性粒細(xì)胞；紅色：血小板；白色箭頭示真菌菌絲；黑色箭頭示為被中性粒細(xì)胞包裹的菌絲圖3 3組菌絲的表現(xiàn)

藍(lán)色：真菌；綠色：Annexin V染色；紅色：PI染色；白色箭頭示早期凋亡細(xì)胞；黑色箭頭示晚期凋亡細(xì)胞圖4 3組中性粒細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

表3 3組中性粒細(xì)胞凋亡率比較 %

3 討論

大量文獻(xiàn)[9-11]顯示，天然免疫的早期應(yīng)答對真菌感染的轉(zhuǎn)歸起著決定性作用。天然免疫細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們不但可直接吞噬真菌孢子或胞外捕獲真菌菌絲，分泌抗真菌成分，產(chǎn)生的化學(xué)因子和細(xì)胞因子還可啟動(dòng)獲得性免疫，其中中性粒細(xì)胞起著尤為重要的作用[4-6,13]。中性粒細(xì)胞減少者易患黏膜真菌病，且真菌很容易播散[14]。真菌感染的角膜各層中均有大量多形核中性粒細(xì)胞浸潤，細(xì)胞的分布和浸潤程度與菌絲的分布和密度呈負(fù)相關(guān)。

血小板是骨髓巨核細(xì)胞脫落下來的胞質(zhì)小塊，在外周血中的壽命為8～10 d。血小板是除紅細(xì)胞外，數(shù)量最多的血液有形成分，以往認(rèn)為其主要參與止血、血栓形成和傷口愈合等病理生理過程，近年來人們發(fā)現(xiàn)血小板具有重要的免疫功能，在天然免疫和獲得性免疫以及炎癥等方面發(fā)揮重要作用[10-11，14-15]。Chatterjee等[16]報(bào)道，抗體依賴的血小板去除鼠角膜上皮被刮除后，角膜創(chuàng)傷部位中性粒細(xì)胞明顯減少，創(chuàng)傷愈合明顯延遲[16]。最近的研究[17]表明：中性粒細(xì)胞的殺菌作用依賴于血小板的參與，如中性粒細(xì)胞殺滅瘧原蟲的作用依賴于血小板的活化和聚集，革蘭陰性菌感染的牙周組織中白細(xì)胞的吞噬功能依賴于血小板、血漿因子和TLR2。

已有研究[18]在分析白色念珠菌引起的全身性念珠菌病與全血的關(guān)系時(shí)，認(rèn)為以小鼠中性粒細(xì)胞、白色念珠菌與血小板個(gè)數(shù)按1∶10∶100的比例用于實(shí)驗(yàn)較為合適。本研究以該濃度為基準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終以血小板與孢子個(gè)數(shù)按20∶1的比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，加入血小板后中性粒細(xì)胞對真菌的吞噬作用增強(qiáng)，且真菌孢子的出芽率和菌絲伸長度下降，中性粒細(xì)胞凋亡率降低，表明血小板可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對真菌的吞噬，且對菌絲生長有抑制作用。

Haselmayer等[19]的研究結(jié)果表明血小板可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化，激活中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，釋放IL-8和髓過氧化物酶等多種物質(zhì)。Chatterjee等[16]的研究結(jié)果顯示血小板衍生的CXCL12可通過CXCR7促進(jìn)單核細(xì)胞的存活，從而顯著抑制單核細(xì)胞凋亡。Au等[20]的研究結(jié)果表明活化的血小板可釋放一種非典型的表皮生長因子受體激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑通過旁分泌信號，維持依賴于DNA依賴蛋白激酶的DNA修復(fù)，從而有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。我們推測血小板增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的抗真菌作用可能是通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化，激活中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，釋放髓過氧化物酶等多種殺真菌效應(yīng)物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，但是具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本研究應(yīng)用血小板、中性粒細(xì)胞和腐皮鐮孢菌共培養(yǎng)體系，采用免疫熒光和轉(zhuǎn)盤共聚焦技術(shù)，證實(shí)了血小板體外可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對真菌的吞噬，抑制真菌的出芽和菌絲的生長，同時(shí)降低中性粒細(xì)胞的凋亡，提示血小板在抗真菌感染中發(fā)揮了重要作用，這為真菌性角膜炎的治療提供了新思路。