劉薇,肖文濤,楊群,鄧維
1.九江市食品藥品檢驗(yàn)所,江西 九江 332000;2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330029
小兒咳喘靈顆粒是由麻黃、金銀花、板藍(lán)根、苦杏仁、甘草、石膏和瓜蔞七味藥組成的成方制劑,收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第四冊(cè)(WS3-B-0688-91),具有宣肺、清熱,止咳、祛痰、平喘功效[1]。臨床常用于上呼吸道感染,氣管炎,肺炎,咳嗽等[2]?,F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅有兩項(xiàng)化學(xué)鑒別,未涉及薄層色譜鑒別及含量測(cè)定指標(biāo)和方法,無法對(duì)處方中的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究擬用薄層色譜法對(duì)制劑中的苦杏仁中的苦杏仁苷進(jìn)行定性鑒別,對(duì)處方中5 種成分鹽酸麻黃堿、(R,S)-告依春、綠原酸、木犀草苷、甘草苷的含量用同一液相色譜系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定,為進(jìn)一步提高小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。
Waters e2695-2695 高效液相色譜儀(美國Waters 公司);YIY-UL300W-C 型超聲波清洗器(上海藝源超聲設(shè)備有限公司);BSA124S 型電子天平(德國sartorius 公司);BP211D 型電子天平(德國sartorius 公司);硅膠G 薄層板(10 cm×20 cm,德國默克公司)。
鹽酸麻黃堿(批號(hào)為171241-201007,含量以99.7%計(jì));(R,S)-告依春(批號(hào)為111753-201106,含量以100% 計(jì));綠原酸(批號(hào)為110753-201716,含量以98.0%計(jì));木犀草苷(批號(hào)為111720-200504,含量以100%計(jì));甘草苷(批號(hào)為111610-201005,含量以94.9%計(jì));苦杏仁苷(批號(hào)為110820-201808,含量以88.2%計(jì))對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇和磷酸為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。3 批小兒咳喘靈顆粒樣品(批號(hào):190405、190512、191203,規(guī)格為每袋2 g)均購自四川恩威制藥有限公司,依次編號(hào)為A1~A3。
供試品溶液:取小兒咳喘靈顆粒6 g,加乙醚低溫超聲30 min,棄去乙醚液,藥渣揮干;加甲醇30 mL 超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)铀? mL 使溶解,通過D101 型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm,長8 cm,加水20 mL 預(yù)洗一次),棄去水液,用氨試液30 mL 洗脫,棄去氨液,再用水10 mL洗脫,棄去水液,用20%乙醇溶液30 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL 使溶解,即得[3]。對(duì)照品溶液:取苦杏仁苷對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液。按處方比例和制法制備缺苦杏仁的陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015 年版四部通則0502)試驗(yàn),吸取供試品溶液3 μL,對(duì)照品溶液與陰性對(duì)照品溶液各3 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5~10 ℃放置12 h 的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以磷鉬酸硫酸溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)且陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1(日光)。
圖1 薄層色譜圖
2.2.1 色譜條件 采用Venusil MP C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸;梯度洗脫;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長:0~15 min,207 nm;15~25 min,327 nm;25~35 min,237 nm;35~40 min,350 nm;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。見表1。
表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表
2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品15.79 mg,置25 mL 容量瓶中,加甲醇適量,超聲處理15 min,取出,放冷加適量甲醇定容,制成629.70 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取綠原酸對(duì)照品9.32 mg,置25 mL 容量瓶中,超聲處理15 min,加適量甲醇定容,制成365.30 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取告依春對(duì)照品9.66 mg,置25 mL容量瓶中,加甲醇適量,超聲處理15 min,放冷,甲醇定容,制成386.40 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取甘草苷對(duì)照品8.01 mg,置25 mL 容量瓶中,超聲處理15 min,加適量甲醇定容,制成304.00 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取木樨草苷對(duì)照品9.17 mg,置25 mL 容量瓶中,超聲處理15 min,加適量甲醇定容,制成366.80 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。
2.2.3 樣品溶液的制備 取樣品,研細(xì),從中稱取約2 g,精密稱定,加入甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率25 kHz)20 min,放冷后,再次稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得樣品溶液。
2.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液以及陰性對(duì)照溶液各10 μL,注入液相色譜儀測(cè)定,比較供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液色譜圖。結(jié)果表明供試品中五種色譜峰與雜質(zhì)峰有較好的色譜分離,陰性對(duì)照無干擾。見圖2。
圖2 高效液相色譜圖:A.對(duì)照品溶液;B.小兒咳喘靈顆粒樣品溶液;C.陰性對(duì)照溶液
2.2.5 線性關(guān)系的考察 取綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.65、7.31、14.61、21.92、29.22、36.50 μg 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,使用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=21 084.595 2X+28.329 1,r=0.999,綠原酸在3.65~36.50 μg/ mL 之間呈良好的線性。
取鹽酸麻黃堿對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別加適量甲醇制成1 mL 中含6.29、12.59、25.18、37.78、50.37、62.97 μg 鹽酸麻黃堿的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,使用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=25 351.509X-5 999.754 3,r=0.999,鹽酸麻黃堿在6.29~62.97 μg/ mL 之間呈良好的線性。
取告依春對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.86、7.72、15.45、23.18、30.91、38.64 μg告依春的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,使用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=180 916.440 2X-10 717.480 5,r=0.999,告依春在3.86~38.64 μg/mL之間呈良好的線性。
取木樨草苷對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.67、7.34、14.67、22.01、29.34、36.68 μg木樨草苷的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,使用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=41 563.933 2X-3 956.141 3,r=0.999,木犀草苷在3.67~36.68 μg/mL 之間呈良好的線性。
取甘草苷對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.04、6.08、12.16、18.24、24.32、30.40 μg 甘草苷的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,使用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=22 763.873 5X-391.572 6,r=0.999,甘草苷在3.04~30.40 μg/ mL 之間呈良好的線性。
2.2.6 精密度試驗(yàn) 取濃度為36.50 μg/mL 的綠原酸對(duì)照品溶液,按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次峰面積,RSD 值為0.40%。取濃度為62.97 μg/mL 的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液,按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定6次峰面積,RSD 值為0.33%。取濃度為38.64 μg/mL的告依春對(duì)照品溶液,按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定6次峰面積,RSD 值為0.29%。取濃度為36.68 μg/mL的木樨草苷對(duì)照品溶液,按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次,RSD 值為0.33%。取濃度為30.40 μg/mL 的甘草苷對(duì)照品溶液,按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次峰面積,RSD 值為0.26%。證明精密度良好。
2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取小兒咳喘靈顆粒2 g,按“2.2.3”的方法制備樣品溶液,精密吸取供試品溶液(批號(hào):191203)10 μL,分別放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果表明樣品溶液中綠原酸、鹽酸麻黃堿、告依春、木樨草苷、甘草苷在24 h 內(nèi)峰面積無明顯變化,RSD 分別為1.2%、1.1%、1.6%、1.8%、1.3%。
2.2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品1.0 g,共六份,置25 mL 量瓶中,分別加入+含鹽酸麻黃堿對(duì)照品(0.103 mg/mL)、綠原酸對(duì)照品(4.040 mg/mL)、告依春對(duì)照品(0.204 mg/mL)、甘草苷對(duì)照品(0.458 mg/mL)和木樨草苷對(duì)照品(0.101 mg/mL)各0.8、1.0、1.2 mL,加入甲醇15 mL,超聲處理(功率300 W,頻率25 kHz)20 min,定容,搖勻,濾過,按上述色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表2~6。
表2 鹽酸麻黃堿回收率
表3 綠原酸回收率
表4 告依春回收率
表5 甘草苷回收率
表6 木樨草苷回收率
2.2.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取小兒咳喘靈顆粒樣品適量,按“2.2.3”的方法制備樣品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定2 次,計(jì)算樣品中5 種成分的含量,結(jié)果見表7。
表7 樣品中5種成分的含量測(cè)定結(jié)果(mg/袋)
現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)處方中苦杏仁藥材進(jìn)行質(zhì)量控制,查閱相關(guān)文獻(xiàn)少見小兒咳喘靈顆粒研究方法中對(duì)苦杏仁的鑒別方法。在試驗(yàn)中參考苦杏仁藥材的薄層方法[16],同時(shí)對(duì)比用索氏提取、二次回流、超聲提取等不同提取方法,結(jié)果分離效果不理想,苦杏仁陰性樣品斑點(diǎn)干擾成分較多。考慮處方中藥材成分互相干擾,組方中有多數(shù)含糖成分,會(huì)造成不易分離且拖尾等,為了改善分離效果,故用大孔樹脂柱層析法,結(jié)果證明用大孔樹脂柱層析法能有效洗脫雜質(zhì)干擾成分,且分離效果較好,陰性對(duì)照無干擾。
對(duì)提取溶劑(甲醇、75%乙醇、50%甲醇、水),提取方法(超聲法、回流法、浸提法),提取時(shí)間(10、30、40、60 min)進(jìn)行了比較,最后確定用50%甲醇超聲處理30 min 為最佳。
比較乙腈-0.1%磷酸、甲醇和水兩種系統(tǒng),其中乙腈-0.1%磷酸峰形及分離度較好,保留時(shí)間也較為理想。也考察了磷酸的濃度0.1%、0.2%、0.3%。其中0.1%的磷酸濃度分離效果較好,故選擇表1中的梯度洗脫法。
木犀草苷的最大波長是350 nm,而鹽酸麻黃堿、(R,S)-告依春、綠原酸、甘草苷分別為207、245、237 nm,不能以同一波長對(duì)這5 種成分進(jìn)行紫外檢測(cè)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)用紫外檢測(cè)液相色譜法直接切換不同波長進(jìn)行含量測(cè)定方法較為方便,同時(shí)在同一個(gè)系統(tǒng)中測(cè)定5 個(gè)組分,故選用波長切換法進(jìn)行檢測(cè)。
本研究對(duì)小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了相應(yīng)提升,建立的薄層鑒別和含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng),能有效對(duì)小兒咳喘靈顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制。