孫赫陽 于 寧 潘德麗 田景振 李 菲

1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355

木犀草苷又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷，是一種天然黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草苷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳、祛痰等多種功效，具有抗呼吸道合胞病毒、流感A型病毒等多種病毒活性[1-2]。同時，對損傷的心肌細胞具有較強的保護作用，并可抑制多種腫瘤細胞增殖，起到抗腫瘤作用[3-4]。部分菊科、忍冬科、豆科等植物中都含有木犀草苷，2015年版《中國藥典》要求將木犀草苷作為金銀花、菊花、錦燈籠控制藥材質(zhì)量的指標(biāo)。因此，木犀草苷作為上述藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，是含有金銀花、菊花等中成藥的主要活性成分，也是此類中成藥進行質(zhì)量控制和考察制劑藥動學(xué)特征的主要指標(biāo)成分[5-7]。本研究建立了HPLC法測定大鼠血漿中木犀草苷的濃度，便于含有木犀草苷的制劑進行藥動學(xué)及生物利用度的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 依利特P230Ⅱ高效液相色譜儀(包括UV230Ⅱ紫外-可見檢測器，EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站，大連依利特分析儀器有限公司)；TDL-40B離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；XW-80A渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；3K30超速冷凍離心機(德國Sigma公司)；UPT-I-107超純水機(成都超純科技有限公司)；BT-25S電子天平(塞多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.1.2試劑 蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y22S6S3719)；木犀草苷對照品(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號17030705)；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.3實驗動物 健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，由山東魯抗醫(yī)藥有限公司提供，合格證號：SCXK(魯)20130001。

1.2 方法及統(tǒng)計學(xué)分析

1.2.1溶液的配制 對照品溶液：精密稱取木犀草苷對照品4.8 mg，加甲醇溶解、定容至50 ml，得到質(zhì)量濃度為96.0 μg·ml-1對照品儲備液。儲備液加甲醇逐級稀釋，分別得到48、24、12、6、3 μg·ml-1系列濃度的溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取蘆丁對照品5.0 mg，加甲醇溶解、定容至50 ml，得到濃度為100 μg·ml-1對照品儲備液。

1.2.2檢測波長的選擇 分別取蘆丁對照品和木犀草苷對照品適量，加甲醇溶解，以甲醇為空白對照，分別在UV波長200～400 nm范圍內(nèi)進行掃描。

1.2.3色譜條件 色譜柱：大連依利特C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，并配以C18預(yù)柱(10 mm × 4.6 mm)；流動相：乙腈-0.2﹪磷酸(20∶80)；內(nèi)標(biāo)：蘆?。粰z測波長：348 nm；流速：1.0 ml·min-1；柱溫：室溫；進樣量：20 μl。

1.2.4血漿樣品的處理 取血漿樣品200 μl，加入內(nèi)標(biāo)蘆丁溶液20 μl，渦旋30 s。分別加入甲醇、乙腈各200 μl，渦旋30 s，4 ℃、15000 r·min-1離心15min。取上清，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按“1.2.3”項下色譜條件進行HPLC測定。

1.2.5線性范圍和定量下限 取大鼠空白血漿160 μl，加入不同濃度的木犀草苷對照品溶液40μl，使得血漿中木犀草苷濃度分別為0.60、1.20、2.40、4.80、9.60、19.20 μg·ml-1。按照“1.2.4”項處理血漿，進樣測定，以木犀草苷與蘆丁的峰面積比值(Ai/A，Y)對木犀草苷質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸。

1.2.6回收率 取大鼠空白血漿160 μl，加入不同濃度木犀草苷對照品溶液40 μl，使血漿中木犀草苷濃度分別為4.8、9.6、19.2 μg·ml-1，每個濃度5個樣品。按照“1.2.4”項下方法處理后進樣測定，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算樣品中所含木犀草苷量，計算方法回收率。

1.2.7精密度 取大鼠空白血漿160 μl，加入木犀草苷對照品溶液，制成血漿中木犀草苷濃度分別為4.8、9.6、19.2 μg·ml-1的樣品，按照“1.2.4”項下方法處理，分別于1d內(nèi)連續(xù)測定5次及5 d內(nèi)每天測定1次，計算日內(nèi)精密度以及5 d內(nèi)的日間精密度。

1.2.8穩(wěn)定性 取大鼠空白血漿160 μl，加入木犀草苷對照品溶液，使木犀草苷在血漿中濃度分別為4.8、9.6、19.2 μg·ml-1，每個濃度樣品各5個，在以下不同條件下處理：室溫放置8 h、-20 ℃凍存1周和-20 ℃冷凍-室溫解凍3次，按照“1.2.4”項下方法處理后進樣測定，測得值與0 h測得值比較計算回收率。

2 結(jié) 果

2.1 檢測波長的選擇

蘆丁對照品和木犀草苷對照品溶液UV波長200～400 nm范圍內(nèi)掃描結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁(A)和木犀草苷(B)對照品紫外掃描圖譜

由圖1可見，蘆丁和木犀草苷均在348 nm波長處有較大吸收峰，故檢測波長確定為348 nm。

2.2 方法的專屬性

大鼠空白血漿、空白血漿加入內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿加入內(nèi)標(biāo)和木犀草苷對照品溶液、樣品血漿加入內(nèi)標(biāo)溶液的色譜圖見圖2。

圖2 大鼠空白血漿(A)、大鼠空白血漿+內(nèi)標(biāo)(B)、空白血漿+內(nèi)標(biāo)+木犀草苷(C)、血漿樣品+內(nèi)標(biāo)(D)HPLC色譜圖 1-內(nèi)標(biāo)；2-木犀草苷

從圖2可知，內(nèi)標(biāo)蘆丁和木犀草苷的保留時間分別為8.0、10.1 min，且主峰、內(nèi)標(biāo)峰及相鄰物質(zhì)峰間可完全分離，內(nèi)源性成分對測定無干擾。

2.3 線性范圍和定量下限

以木犀草苷與蘆丁的峰面積比值(Ai/A，Y)對木犀草苷質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.0865X+0.0232，r=0.9980。結(jié)果表明，木犀草苷在0.60～ 19.20 μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.60 μg·ml-1。

2.4 回收率

低、中、高三個濃度的血漿樣品中木犀草苷的方法回收率結(jié)果見表1。

表1 木犀草苷在大鼠血漿中的方法回收率

2.5 精密度

日內(nèi)精密度以及日間精密度結(jié)果見表2。

表2 木犀草苷在大鼠血漿中的精密度

結(jié)果表明，低、中、高三個濃度的血漿樣品中木犀草苷的回收率在90.53%～94.97%，RSD均小于6%，說明該法的方法回收率符合樣品測定要求。

由表2可見，樣品日內(nèi)和日間的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性

木犀草苷在大鼠血漿中的穩(wěn)定性結(jié)果見表3。

表3 木犀草苷在大鼠血漿中的穩(wěn)定性

由表3可見，木犀草苷血漿樣品在不同處理條件下均穩(wěn)定，符合樣品測定要求。

3 討 論

結(jié)合相關(guān)文獻[8-9]報道，實驗中分別考察了金絲桃苷、黃芩苷、刺五加苷B、槲皮素作為內(nèi)標(biāo)的情況。結(jié)果表明，在流動相為乙腈-0.2%甲酸(20∶80)時，金絲桃苷的保留時間為9.6 min，與木犀草苷峰無法完全分離；黃芩苷、刺五加苷B和槲皮素的保留時間均大于20 min，與木犀草苷保留時間相差過多。蘆丁與木犀草苷的保留時間接近，且二者的色譜峰完全分離，利于提高檢測的準(zhǔn)確度和效率。同時，二者在348 nm均有較強吸收，可以采用同一波長進行測定，避免了切換波長可能導(dǎo)致基線波動的情況出現(xiàn)。血漿樣品處理采用的是蛋白沉淀法，固定有機溶劑和血漿的體積比為2∶1，單用甲醇沉淀蛋白木犀草苷的提取率為56.95%，采用甲醇和乙腈(1∶1)處理血漿木犀草苷提取率達到85.0%以上。因此，選擇甲醇和乙腈(1∶1)為溶劑采用蛋白沉淀法處理樣品。該法藥物的回收率高，重現(xiàn)性好，且操作簡便、快速，可用于測定血漿中木犀草苷的濃度。