張瀟文　裘蘭蘭　徐世龍　吳瑤　陳欣悅

摘要：目的：應(yīng)用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)計算平臺（TCMIP V2.0）分析復(fù)方銀花解毒顆粒的有效成分，潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制。方法：應(yīng)用TCMIP V2.0計算平臺中中藥材數(shù)據(jù)庫和中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫篩選方劑中藥材的活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)，以疾病的臨床癥狀作為表型查找候選靶點(diǎn)，在中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)模板構(gòu)建疾病-方劑靶標(biāo)分析網(wǎng)絡(luò)，利用自定義多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可視化功能建立“方劑-中藥材-成分-核心靶標(biāo)-通路-疾病”多層次圖，分析評估藥物治療疾病的潛在作用機(jī)制。結(jié)果：共篩選出215個化學(xué)成分成分和1218個候選靶標(biāo)。建立疾病-方劑標(biāo)靶網(wǎng)絡(luò)后，篩選出藥材中活性成分29種，作用于120個核心靶標(biāo)和23條主要通路。結(jié)論：復(fù)方銀花解毒顆?？赏ㄟ^多組分配伍、多靶點(diǎn)、多通路系統(tǒng)調(diào)控疾病。該研究為復(fù)方銀花解毒顆粒的臨床合理使用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：整合藥理學(xué);復(fù)方銀花解毒顆粒;作用機(jī)制

復(fù)方銀花解毒顆粒（YHJD）辛涼解表，清熱解毒?？捎糜诎l(fā)熱，鼻塞流涕，咳嗽，咽痛，頭痛，全身酸痛，苔薄白或微黃，脈浮數(shù)等癥狀。臨床研究表明，該復(fù)方藥物對感冒，各種炎癥具有良好的治療效果。故研究該藥對的有效成分，作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制具有極大的意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病發(fā)生發(fā)展過程，從改善或恢復(fù)網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認(rèn)識藥物與機(jī)體間的相互作用。中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine， TCMIP） v2.0利用人工智能數(shù)據(jù)挖掘、計算機(jī)虛擬計算、生物信息網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，組成中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘、組方用藥規(guī)律分析等七大分析模塊，被廣泛用于闡釋中藥作用機(jī)制、指導(dǎo)新藥研發(fā)等方面 。 本研究擬采用TCMIP v2.0計算平臺構(gòu)建“方劑-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)圖。為理解復(fù)方銀花解毒課題防治疾病的作用機(jī)制提供一定參考，并為活性成分的新藥開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1復(fù)方銀花解毒顆?；瘜W(xué)成分及候選靶標(biāo)的搜集

通過TCMIP V2.0計算平臺的中藥方劑數(shù)據(jù)庫，輸入“青蒿”、“金銀花”、“荊芥”、“薄荷”、“野菊花”、“大青葉”、“連翹”、“鴨跖草”、“淡豆豉”、“前胡”搜索得到復(fù)方銀花解毒顆粒的相關(guān)化學(xué)成分及候選靶標(biāo)，篩選相似性分?jǐn)?shù)>0.8的藥物所對應(yīng)的靶標(biāo)，建立方劑的化學(xué)成分及靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。

癥候是中醫(yī)整體觀、辨證論治、方劑干預(yù)這一特色診療體系的核心內(nèi)容，也可看作是對疾病相關(guān)的理解證候的生物學(xué)基礎(chǔ)，是認(rèn)識中藥藥性等中藥特色內(nèi)涵和中藥傳統(tǒng)功效的一個關(guān)鍵。TCMIPV2.0平臺依托“人類表型本體數(shù)據(jù)庫”（HPO）和“中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫”（ETCM），通過證候相關(guān)表型組合獲得中醫(yī)證候相關(guān)基因集，進(jìn)行功能挖掘。本研究根據(jù)主要臨床癥狀“fever”、“cough”、“asthma”、“anergy”、“dyspnea”、“nasal obstruction” 、“respiratory tract infection”作為表型的關(guān)鍵詞構(gòu)建疾病的靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。

在“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊下，TCMIPV2.0平臺基于目標(biāo)疾?。ɑ蜃C候）基因和中藥（含方劑）候選靶標(biāo)之間的相互作用信息，可構(gòu)建“疾病-方劑”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，在自定義多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可視化功能中，可根據(jù)中藥方劑、中藥成分、核心靶標(biāo)、通路、疾病和證候之間的關(guān)聯(lián)性，任意選擇不同類型的節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建中藥多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

2.結(jié)果

2.1復(fù)方銀花解毒顆粒候選靶標(biāo)的篩選及功能分析

通過計算平臺的TCMIP V2.0中藥材數(shù)據(jù)庫，得到方劑中有效化學(xué)成分共215個，其中前胡21個，大青葉14個，荊芥32個，薄荷28個，連翹49個，金銀花46個，青蒿19個，鴨跖草6個。通過檢索中藥方劑靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫，查詢得到參與生物功能過程的靶標(biāo)基因總數(shù)為1218個，其中前胡54個，大青葉321個，荊芥115個，薄荷225個，連翹189個，金銀花133個，青蒿144個，鴨跖草37個。

2.2疾病候選靶標(biāo)的篩選

以疾病表型“fever， cough， nasal obstruction， asthma， dyspnea and respiratory tract infection”篩選出疾病的候選靶點(diǎn)437個。利用TCMIP2.0中中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘模塊建立“疾病基因-藥物靶標(biāo)分析網(wǎng)絡(luò)”，結(jié)果顯示與復(fù)方銀花解毒顆粒及相關(guān)的核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)共357個，對能夠發(fā)揮多重協(xié)同作用的靶標(biāo)進(jìn)行度degree、相似度closeness、中位數(shù)卡值betweenness綜合排序后，獲得排名前20位的核心靶標(biāo)（見表1）。

在排名前20的核心靶標(biāo)中，我們發(fā)現(xiàn)趨化因子受體占據(jù)較高比例，包括趨化因子受體1-9（CCR1-CCR9）以及CXCR1，CXCR2，趨化因子受體屬于G蛋白歐聯(lián)受體，根據(jù)其結(jié)合的配體不同分為4個亞家族：CCR、CXCR、XCR和CX3CR。其中CCR亞族已克隆11種（CCR1-CCR11），CXCR亞族（CXCR1-CXCR6）。CCR1對多種人類CC趨化因子有反應(yīng)，CCR2的cDNA可以編碼兩個蛋白質(zhì)CCR2A和CCR2B。CCR2B是主要表達(dá)形式，并在慢性炎癥中起作用。CCR3主要在嗜酸性細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，可參與TH2反應(yīng)，并在哮喘和特應(yīng)性皮炎在內(nèi)的過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。CCR4參與全身性的淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，CCR7在T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞運(yùn)輸中起重要作用，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表面，CCR9在小腸淋巴細(xì)胞中高水平表達(dá)，可能參與胃腸道的免疫應(yīng)答。

基于復(fù)方銀花解毒顆粒候選靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)信息，構(gòu)建了復(fù)方藥物的“方劑-成分-疾病-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)可視化圖，見圖2。由圖2可見，復(fù)方銀花解毒顆粒治療疾病作用主要與29個化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)，作用于23條主要通路120個核心靶標(biāo)，體現(xiàn)了多組分與多靶點(diǎn)之間共同作用機(jī)制，符合中藥復(fù)方作用的特點(diǎn)。方中中藥材的核心成分信息見表2。

圖2中不同顏色的靶標(biāo)按照基因間相互作用的緊密度，采用greedy oprimication of modularity算法鑒定的高度內(nèi)聯(lián)的子模塊，根據(jù)節(jié)點(diǎn)間交聯(lián)性計算結(jié)果進(jìn)行劃分。其中：黃色靶標(biāo)主要富集在TP53調(diào)節(jié)代謝基因、呼吸電子傳遞通路上;粉色靶標(biāo)主要富集在TNFR1信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)、GG-NER中的雙重切口、IkBA辯題導(dǎo)致EDA-ID、白介素4和白介素13相關(guān)通路;紫色靶標(biāo)主要富集在白介素受體SHC信號、促紅細(xì)胞生成素激活磷脂酶Cγ、IL-4和13相關(guān)通路;淺綠色靶標(biāo)主要富集在G蛋白α（i、q）信號事件、趨化因子受體結(jié)合趨化因子通路;深綠色靶標(biāo)則富集在蛋白酶降解GLI2相關(guān)通路。

表2可以看出，在該方劑中金銀花起作用的核心成分最多，有10種，這也符合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中藥復(fù)方制劑中君藥起主要作用的特點(diǎn)。

3.討論

復(fù)方銀花解毒顆粒作為中醫(yī)藥傳統(tǒng)方劑，研究其活性成分及其作用機(jī)制對該方的臨床應(yīng)用具有重要意義。本研究通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)計算平臺（TCMIP2.0），以臨床常見癥狀發(fā)熱、咳嗽、哮喘、乏力、鼻塞、呼吸困難、呼吸道感染作為表型進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，建立方劑-疾病核心網(wǎng)絡(luò)，得出復(fù)方銀花解毒顆粒在治療疾病時起最重要作用的有29種活性成分，通過120個核心靶標(biāo)，23條富集通路進(jìn)行調(diào)控。排名靠前的核心靶標(biāo)有1型腺苷酸環(huán)化酶，細(xì)胞腫瘤抗原p53，CC型去化因子受體（2-9型），白細(xì)胞介素4，19受體亞基，可能通過調(diào)控細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路，炎癥反應(yīng)，免疫反應(yīng)，TP53調(diào)節(jié)代謝基因，TNFR1信號傳導(dǎo)調(diào)借起到清熱解毒、疏風(fēng)散熱，調(diào)理咽喉腫痛，辛涼解表等作用，起到多靶點(diǎn)、多組分配伍，多通路的系統(tǒng)調(diào)控作用。

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[基金項目]江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院自然科學(xué)研究規(guī)劃項目（20204113）;江蘇省大學(xué)生實踐創(chuàng)新項目（202012682003Y）;江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目（No.20188103）

[通訊作者] 裘蘭蘭，講師，藥學(xué)碩士，主要從事藥物分析研究工作