陳麗娟，張宏，張健，鄧大立，吳瑕

宮頸癌是全球女性癌癥死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有新增宮頸癌患者50萬例，并有30萬人死于宮頸癌[1]。早期宮頸癌可通過手術(shù)切除治愈，但宮頸癌患者多為晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，且放化療未能取得理想效果，患者預(yù)后較差[2-4]。因此，尋找新的宮頸癌治療策略至關(guān)重要。羅哌卡因是一類長(zhǎng)效局麻藥，可用于減少急性、慢性和癌癥疼痛[5]。羅哌卡因和舒芬太尼的聯(lián)用可有效減輕宮頸癌根治術(shù)術(shù)后疼痛，是婦科手術(shù)理想的鎮(zhèn)痛方法[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因可抑制乳腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞增殖以及結(jié)腸癌皮下瘤的生長(zhǎng)，具有抗腫瘤作用[7-8]。但羅哌卡因?qū)m頸癌生物學(xué)行為的影響尚不清楚。本研究探討了羅哌卡因?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響，初步分析其潛在分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HeLa細(xì)胞購于上海通派生物科技有限公司；青鏈霉素雙抗溶液購于北京索萊寶生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司；羅哌卡因(CAS號(hào)：98717-15-8，純度98%)購于上海研生實(shí)業(yè)有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于美國Sigma公司；RIPA裂解液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購于上海碧云天公司；山羊抗兔IgG、細(xì)胞周期依賴性激酶4(Cycle-dependent kinase 4，CDK4)兔單克隆抗體、MMP-2兔多克隆抗體、Bcl2兔單克隆抗體、Bax兔單克隆抗體購于美國Abcam公司；Akt兔多克隆抗體以及β-actin、p-Akt兔單克隆抗體購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞接中含DMEM培養(yǎng)基(添加10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗溶液)培養(yǎng)瓶在37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度約為80%時(shí)，用胰酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 按照每孔5×103個(gè)細(xì)胞數(shù)(100 μL)的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa接種于96孔板，貼壁后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用含不同濃度(0、100、200和400 μg/mL)羅哌卡因的DMEM培養(yǎng)液(100 μL/孔)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞48 h，參考CCK-8試劑盒加入CCK-8試劑。全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。

1.2.3 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 侵襲實(shí)驗(yàn)：用DMEM培養(yǎng)基按照1∶8比例稀釋Matrigel，取50 μL均勻鋪于于Transwell小室膜表面，4℃風(fēng)干。收集羅哌卡因(400 μg/mL)處理48 h的HeLa細(xì)胞和正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞后，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸使細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。向Transwell上室加入200 μL細(xì)胞懸液，取500 μL含DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)加入向24孔板下室，常規(guī)培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，隨后將Transwell小室倒置于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察、拍照、計(jì)數(shù)，以5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)平均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)目。遷移實(shí)驗(yàn)用未包被基質(zhì)膠的小室，其他步驟參考侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化羅哌卡因(400 μg/mL)處理48 h的HeLa細(xì)胞和正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞2次，用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整為細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。參照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說明分別加入Annexin V-FITC和PI，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western bot檢測(cè)CDK4、MMP-2、Bcl2、Bax以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 收集羅哌卡因(400 μg/mL)處理48 h的HeLa細(xì)胞和正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，15 000 rpm離心10 min獲得的上清液即為細(xì)胞總蛋白。將適量細(xì)胞蛋白與等體積的1×上樣緩沖液混合，100℃沸水浴3 min變性細(xì)胞蛋白。按照每孔30 μg加樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后利用半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將膜置于孵育盒內(nèi)，4℃下用5%脫脂牛奶封閉膜過夜。TBST洗膜后，室溫下分別加入CDK4(1∶2 000)、MMP-2(1∶500)、Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、p-Akt(2∶1 000)、Akt(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體孵育膜2 h，TBST洗膜10 min×3次。用Ⅱ抗孵育1 h后，TBST洗膜10 min×3次?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影后，以β-actin為內(nèi)參，Graphpad軟件分析目的條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 羅哌卡因?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7增殖的影響

采用不同濃度羅哌卡因處理HeLa細(xì)胞和Ect1/E6E7細(xì)胞48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，結(jié)果顯示，與0 μg/mL組比較，100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL組HeLa細(xì)胞的增殖活力顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著羅哌卡因濃度增加，其對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增加；與0 μg/mL組比較，400 μg/mL組Ect1/E6E7細(xì)胞的增殖活力顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，100 μg/mL、200 μg/mL組Ect1/E6E7細(xì)胞的增殖活力沒有明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1，表明羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞有抑制作用且在較低濃度時(shí)對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用，選擇較低濃度的200 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞增殖的影響

2.2 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響

采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細(xì)胞48 h，Transwell法檢測(cè)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，羅哌卡因處理組HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)目顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表2。提示羅哌卡因可抑制HeLa細(xì)胞遷移和侵襲。

圖1 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表2 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.3 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞凋亡的影響

采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，羅哌卡因處理組HeLa細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3和圖2。提示羅哌卡因可促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。

圖2 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞凋亡的影響

表3 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞凋亡的影響

2.4 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細(xì)胞48 h，Western blot檢測(cè)CDK4、Bcl-2、MMP-2和Bax蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，羅哌卡因處理組HeLa細(xì)胞CDK4、MMP-2、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細(xì)胞48 h，Western blot分析PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，羅哌卡因處理組HeLa細(xì)胞總PI3K和Akt蛋白的表達(dá)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。提示羅哌卡因可抑制HeLa細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路活化。

圖4 Western blot檢測(cè)羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞 PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

羅哌卡因是單一對(duì)映結(jié)構(gòu)體長(zhǎng)效酰胺類局麻藥，已廣泛用于介入性手術(shù)。最近研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行腫瘤切除術(shù)時(shí)使用局部麻醉可以減少癌癥復(fù)發(fā)，提高生存率[5]。一定濃度的局部麻醉藥可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。本研究擬探討羅哌卡因?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響和其潛在的分子機(jī)制。

近年來，羅哌卡因在癌癥研究中的作用受到越來越多的關(guān)注。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因可抑制肝癌細(xì)胞活力，并通過破壞線粒體功能激活caspase-3信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；Yang等[11]研究表明羅哌卡因通過下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2磷酸化水平對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，但對(duì)細(xì)胞的侵襲能力無明顯影響；然而，羅哌卡因通過抑制Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1/jun激酶/樁蛋白/黏著斑激酶(Rac1/JNK/paxillin/FAK)通路卻具有強(qiáng)大的抗食管鱗癌細(xì)胞遷移作用[12]。本研究結(jié)果顯示，羅哌卡因可顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖活力，隨著羅哌卡因濃度的增加，其對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。同時(shí)，羅哌卡因還可顯著抑制HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。CDK4是在G1期中發(fā)揮重要作用，CDK4通過與Cyclin D1結(jié)合形成CDK4/Cyclin D1復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞周期向S期推進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞過度增殖，抑制CDK4表達(dá)可抑制腫瘤發(fā)生[13]?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)可降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，在宮頸癌轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表達(dá)減少,Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)增多是細(xì)胞凋亡的主要特征。本研究顯示，羅哌卡因作用于HeLa細(xì)胞，能夠抑制CDK4、MMP-2和Bcl2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，與功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。提示羅哌卡因?qū)eLa細(xì)胞具有抑制增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡的作用。

PI3K/Akt途徑是調(diào)控多種生物過程的重要通路，它在許多癌癥中異常活躍。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，減少凋亡并促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[14]。在宮頸癌中PI3K/Akt通路經(jīng)常發(fā)生失調(diào)，抑制PI3K/Akt通路可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[15-16]。Zheng等[17]研究顯示羅哌卡因通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制慢性髓系白血病的生長(zhǎng)和存活。本研究結(jié)果顯示，羅哌卡因可降低HeLa細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化,推測(cè)羅哌卡因可能通過抑制PI3K/Akt通路進(jìn)而在宮頸癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上，羅哌卡因可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究闡明了羅哌卡因?qū)m頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為羅哌卡因在宮頸癌治療中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。