朱其舟，舒寬勇，陳和平，肖仲清*

子宮內(nèi)膜癌是我國(guó)常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性健康。眾多研究表明抑癌基因異常失活或原癌基因高度激活及其相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)失調(diào)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展存在著密切關(guān)系。深入探討子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的特異性蛋白分子及其分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)其治療及預(yù)后具有重要意義。

DJ-1(RS/PARK7/CAP1)蛋白是1997年首次報(bào)道[1]的一種絲裂原依賴性癌基因產(chǎn)物。近年來隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)DJ-1在不少腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中可能起重要作用[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中過表達(dá)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，從而利于子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展[3-4]。然而，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中DJ-1蛋白表達(dá)上調(diào)的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。研究表明DNA甲基化介導(dǎo)的miRNAs沉默是導(dǎo)致其所調(diào)控的腫瘤相關(guān)靶基因表達(dá)上調(diào)的重要機(jī)制之一[5]。我們前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)miR-128-2可能是DJ-1表達(dá)的重要調(diào)控因子。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)存在DNA甲基化修飾，并且作為腫瘤抑制因子參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞增殖[5-6]。以上強(qiáng)烈提示子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中DJ-1表達(dá)上調(diào)很可能與DNA甲基化調(diào)控的miR-128-2表達(dá)缺失密切相關(guān)。

為此，本研究擬分別對(duì)新鮮子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中miR-128-2 DNA甲基化水平以及miR-128-2表達(dá)水平和DJ-1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并分析miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平與miR-128-2表達(dá)、DJ-1表達(dá)以及臨床病理因素之間的相關(guān)性，擬從組織學(xué)水平尋找miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中DJ-1表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織標(biāo)本 本研究所采用的63例子宮內(nèi)膜癌組織及其相配對(duì)的癌旁子宮內(nèi)膜組織(距腫瘤邊緣>1.5 cm)標(biāo)本均取自江西省婦幼保健院(2019年9月至2020年10月)，同時(shí)收集患者病理資料?；颊咝g(shù)前未接受過相關(guān)治療(包括手術(shù)、放化療或內(nèi)分泌治療等)。病理學(xué)診斷依據(jù)為世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的子宮內(nèi)膜腫瘤組織學(xué)類型修訂方案，臨床分期依照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩位病理醫(yī)師根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行證實(shí)，確診子宮內(nèi)膜癌及分期。本研究取得了江西省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意文書。

1.1.2 主要試劑 TRIzol總RNA提取試劑盒購自北京全式金公司；FastKing RT Kit(With gDNase)、SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)、miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit、miRcute Plus miRNA qPCR Kit(SYBR Green)購自TIANGEN公司；EasyPure Genomic DNA kit購自北京全式金公司；EZ DNA Methylation-Gold Kit購自美國(guó)Zymo research公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購自德國(guó)Qiagen公司；總蛋白提取PIRA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京普利來公司；DJ-1一抗購自美國(guó)abcam公司；GAPDH多克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗山羊IgG/辣根酶標(biāo)記、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記購自北京中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光實(shí)時(shí)定量 甲基化特異性PCR(qMSP)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平

1.2.1.1 組織DNA提取及轉(zhuǎn)化 組織DNA提取參照北京全式金公司EasyPure Genomic DNA kit說明書進(jìn)行操作。提取DNA后進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，參照EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒(ZYMO)說明書進(jìn)行。

1.2.1.2 定量甲基化特異性PCR檢測(cè) ① miR-128-2的DNA甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)來自參考文獻(xiàn)[7-8]，具體序列詳見下頁表1。引物由廣州銳博生物公司合成。 ② 以修飾后DNA模板配制qMSP反應(yīng)體系：Power SYBR Green PCR Master Mix10 μL、引物(50 nM)1 μL、修飾后DNA模板1μL、RNase-free ddH2O 8 μL，將其放入實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃ 15 min，然后以94℃ 30 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，加一步熔解曲線來檢測(cè)引物特異性，95℃ 15 s，60℃ 45 s，95℃ 15 s。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。qMSP結(jié)果分析：根據(jù)公式計(jì)算miR-128-2的DNA甲基化水平：miR-128-2的DNA甲基化程度(%)=[1/(1+2-ΔCt)]×100%,ΔCt=CtU-CtM(U:非甲基化，M:甲基化)。

表1 qMSP所用引物

1.2.2 Real time quantitative-PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2和DJ-1 mRNA表達(dá)水平

1.2.2.1 組織中總RNA提取 組織按照北京全式金公司的TRIzol試劑盒操作說明書提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)已提取RNA的完整性，Bio-Rad微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA濃度和純度，以RNA濃度最低者對(duì)所有樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.2.2 miRNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) ① miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照TIANGEN公司miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行操作。選擇完整性良好的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。② miRNA逆轉(zhuǎn)錄后的定量PCR反應(yīng)(qPCR)參照TIANGEN公司miR-cute Plus miRNA qPCR Detection Kit說明書進(jìn)行操作，以U6為內(nèi)參照，miR-128-2及U6引物來自參考文獻(xiàn)[9-10]，由廣州銳博生物公司合成，具體引物序列詳見表2。③ 按照試劑盒說明書制作反應(yīng)體系：2×miRcute Plus miRNA、PreMix(SYBR&ROX)10.0 μL、Forward Primer(10 μM)1.0 μL、Reverse Primer(10 μM)1.0 μL、cDNA模板 2.0 μL、RNase-Free ddH2O 補(bǔ)至20 μL，并置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)，進(jìn)行qPCR結(jié)果分析，以U6作為內(nèi)參，計(jì)算miR-128-2相對(duì)表達(dá)水平，計(jì)算公式：miR-128-2相對(duì)表達(dá)水平=2-ΔΔCt，ΔCt=CtmiR-128-2-CtU6，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

1.2.2.3 mRNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) ① mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照TIANGEN公司FastKing RT Kit(With gDNase) 說明書進(jìn)行操作。DJ-1和內(nèi)參照GAPDH引物來自參考文獻(xiàn)[11]，由廣州銳博生物公司合成，具體引物序列詳見表2，參照TIANGEN公司SuperRealPreMix Plus(SYBR Green) kit建議體系，組織均以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2×SuperReal PreMix Plus10 μL、正向引物(10 μM)0.8 μL、反向引物(10 μM)0.8 μL、cDNA模板2 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、RNase-free ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序預(yù)變性：95℃ 15 min；PCR反應(yīng)：40個(gè)循環(huán)，95℃ 10 s，60℃ 30 s；熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 45 s，95℃ 15 s。② qPCR結(jié)果分析：以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算DJ-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，計(jì)算公式：DJ-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平=2-ΔΔCt，ΔCt=CtDJ-1-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

表2 qPCR所用引物

1.2.3 Western Blot測(cè)定組織中DJ-1蛋白表達(dá)水平 ① 取出凍存組織50 mg，液氮下研磨成粉狀，按照蛋白質(zhì)提取試劑盒說明加入細(xì)胞裂解液，按照北京普利來公司蛋白提取試劑盒說明提取組織總蛋白，提取時(shí)中加入Aprotinin及Leupeptin蛋白酶抑制劑；用BCA法測(cè)蛋白濃度；按配膠試劑盒說明配置12%分離膠和5%積層膠；相同蛋白總量的樣本經(jīng)上樣緩沖液(十二烷基硫酸鈉SDS、巰基乙醇、二硫蘇糖醇DTT及溴酚藍(lán)等) 95℃變性 5 min 后加樣恒壓電泳，積層膠85v，分離膠120v，以裂解液加上樣緩沖液作為空白對(duì)照；待預(yù)染蛋白Marker提示靶蛋白區(qū)分離后停止電泳；切膠，留取靶蛋白區(qū)，把聚丙烯酰胺凝膠上已分離的蛋白印跡轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜“三明治”夾穩(wěn)流(90mA)濕轉(zhuǎn)90 min；麗春紅染色；將PVDF素膜置于TTBS中，緩搖10 min，然后膜于封閉液中37℃搖床緩慢平搖3 h，將封閉好的PVDF膜放入雜交袋中，加入封閉液稀釋的一抗(DJ-1抗體以1∶1 000稀釋，GAPDH抗體以1∶3 000稀釋)，4℃孵育過夜或室溫平搖3 h，TTBS洗膜20 min×3次；加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記二抗(稀釋比例均為1∶3 000)，共同孵育60 min，孵育結(jié)束，TTBS洗膜20 min×3次；采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光，通過自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍攝。② 圖像分析：在ImageTool圖形分析軟件上讀取目的條帶的密度掃描值。以各組GAPDH條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的目的蛋白表達(dá)量，進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DJ-1 mRNA及蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異

我們課題組前期工作證明DJ-1在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，但其表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制尚未闡明。為了進(jìn)一步探討子宮內(nèi)膜癌中DJ-1表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制，我們應(yīng)用qRT-PCR及Western blot技術(shù)再次檢測(cè)了63例子宮內(nèi)膜癌組織及其癌旁組織中DJ-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平差異。結(jié)果與前期工作相一致，與癌旁組織相比，DJ-1 mRNA(見圖1)及蛋白(見圖2)在子宮內(nèi)膜癌組織中呈過表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 miR-128-2在子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異

生物信息軟件預(yù)測(cè)及相關(guān)文獻(xiàn)提示DJ-1可能是miR-128-2的靶基因。為了探討子宮內(nèi)膜癌中DJ-1表達(dá)上調(diào)是否與miR-128-2有關(guān)，我們利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步對(duì)63例子宮內(nèi)膜癌組織及其配對(duì)的癌旁組織中miR-128-2表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如下頁圖3所顯示，與癌旁組織相比，miR-128-2在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 qRT-PCR法檢測(cè)，與癌旁組織相比，DJ-1 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)。**P<0.01。

圖2 Western blot法檢測(cè)，與癌旁組織相比，DJ-1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)。**P<0.01。T：腫瘤組織；NT：癌旁組織。

2.3 miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平在子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織中的差異

研究表明miRNAs等抑癌基因表達(dá)下調(diào)或缺失在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程中扮演著重要角色。而啟動(dòng)子區(qū)高DNA甲基化，則是抑癌基因失調(diào)的一個(gè)重要原因。miR-128-2被報(bào)道存在DNA甲基化修飾，并作為抑癌基因參與了多種腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控。我們使用CpG Island Searcher軟件也發(fā)現(xiàn)miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)的-166至+181位點(diǎn)347bp序列內(nèi)存在10個(gè)CpG(見下頁圖4A)。重要的是，我們通過qMSP分別檢測(cè)了63例子宮內(nèi)膜癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平。結(jié)果如下頁圖4B所示，與癌旁組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平明顯升高(P<0.01)。

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2 DNA甲基化與miR-128-2、DJ-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

為了進(jìn)一步明確子宮內(nèi)膜癌中miR-128-2啟動(dòng)子DNA甲基化、miR-128-2表達(dá)以及DJ-1 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系，我們使用統(tǒng)計(jì)軟件評(píng)估了子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2 DNA甲基化與miR-128-2及DJ-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平之間的相關(guān)性。結(jié)果如57頁圖5所示，在子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平與miR-128-2表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.9693，P<0.001)，而與DJ-1 mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.8762，P<0.001)；此外，miR-128-2表達(dá)水平與DJ-l mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.8140，P<0.001)。

2.5 miR-128-2 DNA甲基化水平、miR-128-2及DJ-1 mRNA表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)合患者臨床病理資料，我們進(jìn)一步分析了miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平、miR-128-2及DJ-1 mRNA表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示詳見下頁表3，miR-128-2 DNA甲基化、miR-128-2及DJ-1 mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的病理類型、細(xì)胞分化程度無關(guān)，而與肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖3 qRT-PCR法檢測(cè)，與癌旁組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2表達(dá)下調(diào)。**P<0.01。

圖4(A) miR-128-2啟動(dòng)子CpG島、CpG位點(diǎn)(短垂直線)和qMSP區(qū)域示意圖(從正向引物到反向引物)。4(B) qMSP法檢測(cè)，與癌旁組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2甲基化增加。**P<0.01。

圖5 Pearson相關(guān)檢驗(yàn)法對(duì)63例子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2 DNA甲基化、miR-128-2表達(dá)和DJ-1 mRNA表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均P<0.001。

表3 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2 DNA甲基化水平、miR-128-2及DJ-1 mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

近年來，隨著人口平均壽命延長(zhǎng)及生活習(xí)慣變化，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)，其發(fā)生和發(fā)展是多因素、多階段、多步驟的一系列復(fù)雜過程，是癌基因、抑癌基因等多種基因表達(dá)的異常改變及協(xié)同作用的結(jié)果。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和識(shí)別子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中特異表達(dá)改變的關(guān)鍵調(diào)控因子，不僅有利于了解其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，而且還將為臨床診治提供新的靶點(diǎn)和干預(yù)環(huán)節(jié)。

DJ-1作為癌基因首次由日本研究者Nagakubo等[1]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，該基因位于人1號(hào)染色體短臂遠(yuǎn)端(1p36.12-1p36.33)，長(zhǎng)為23,629bp，包含8個(gè)外顯子，其中外顯子1A和1B不編碼，而外顯子2～7含有開放性閱讀框，其編碼的DJ-1蛋白含有189個(gè)氨基酸殘基、分子量約為20 kd。研究表明DJ-1蛋白高度保守，屬于ThiJ/PfpI超家族，主要以同源二聚體的形式廣泛存在于機(jī)體各個(gè)組織器官，并參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗氧化應(yīng)激、分子伴侶、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬等多種細(xì)胞生命活動(dòng)[12]。

早期研究主要集中在DJ-1基因純合缺失和錯(cuò)義突變與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展之間關(guān)系的領(lǐng)域。然而，自2001年Naour等[13]首次發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白異常過表達(dá)與乳腺癌密切相關(guān)后，DJ-1與腫瘤的關(guān)系引起了學(xué)者們廣泛關(guān)注。相繼有不少研究提示DJ-1的表達(dá)改變可能是多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因素。我們前期研究證實(shí)DJ-1蛋白在子宮內(nèi)膜癌中過表達(dá)，并可能作為重要的生物標(biāo)志物對(duì)子宮內(nèi)膜癌診斷具有潛在臨床價(jià)值[3,14]。本研究再次證實(shí)DJ-1蛋白在63例子宮內(nèi)膜癌組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)。但有關(guān)DJ-1蛋白在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào)的上游分子調(diào)控機(jī)制目前尚未完全明確。

miRNAs作為一種可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。研究表明，許多miRNAs位于CpG島中或附近，其表達(dá)水平易受異常DNA甲基化所調(diào)控[15]。具有抑癌作用的miRNAs因高DNA甲基化而轉(zhuǎn)錄沉默，導(dǎo)致其靶向調(diào)控的下游促癌基因異常上調(diào)表達(dá)，從而促使眾多腫瘤發(fā)生發(fā)展[5,15-16]。因此，從miRNAs基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化表觀遺傳學(xué)的視角出發(fā)，探討腫瘤特異性相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制是一條重要和關(guān)鍵的途徑。

miR-128-2是近來頗受關(guān)注的與腫瘤發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)的miRNA分子，與miR-128-1是同屬于miR-128基因的兩個(gè)亞型[17]。miR-128-2與miR-128-1分別定位于人類染色體3p22.3和2q21.3上，位于ARPP-21(cAMP-regulated phosphoprotein)和R3HDM1(R3H domain containing 1)基因的內(nèi)含子內(nèi)，兩者在機(jī)體多種組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)模式并不相同[18]。近來研究表明，miR-128-2和miR-128-1在多種腫瘤細(xì)胞中均呈現(xiàn)異常表達(dá)，這種異常表達(dá)通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)，最終使其在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面起到重要調(diào)控作用。有趣的是，miR-128-2和miR-128-1在不同的惡性腫瘤中表達(dá)不同，并可能發(fā)揮著截然不同的作用。一方面有證據(jù)顯示miR-128-1在肝細(xì)胞癌[19]、乳腺癌[20]等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可能是一個(gè)潛在的促癌基因。然而，同時(shí)又有研究提示miR-128-2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[21]、胃癌[22]、非小細(xì)胞肺癌[23]、MLL-AF4急性淋巴細(xì)胞性白血病[24]等腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)，發(fā)揮著類似抑癌基因的作用。

我們前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)miR-128-2可能是DJ-1表達(dá)的重要調(diào)控因子。更為重要的是，miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)被報(bào)道存在DNA甲基化修飾，并且作為腫瘤抑制因子參與了多種腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控[5-6]。此外，我們使用CpG Island Searcher軟件也檢測(cè)出miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)存在DNA甲基化修飾位點(diǎn)。據(jù)此，我們推測(cè)子宮內(nèi)膜癌中DJ-1異常過表達(dá)很可能與miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)高DNA甲基化致其表達(dá)沉默有關(guān)。于是，為了驗(yàn)證上述推測(cè)，我們首先在子宮內(nèi)膜癌組織水平上尋找相關(guān)證據(jù)，檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平及其表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比較，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平顯著增加，而其表達(dá)水平顯著下調(diào)；同時(shí)，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中miR-128-2 DNA甲基化水平與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而與DJ-1 mRNA水平呈正相關(guān)，此外，miR-128-2表達(dá)水平與DJ-1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果提示啟動(dòng)子區(qū)異常DNA甲基化可能是影響子宮內(nèi)膜癌中miR-128-2表達(dá)，進(jìn)而影響DJ-1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制之一。除此之外，通過臨床資料我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-128-2 DNA甲基化水平、miR-128-2以及DJ-1表達(dá)水平均與子宮內(nèi)膜癌患者的病理類型、分化程度無關(guān)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，提示miR-128-2 DNA甲基化可能與子宮內(nèi)膜癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且可能是子宮內(nèi)膜癌療效判定和預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)。

綜上，本研究在組織水平佐證了子宮內(nèi)膜癌中DJ-1表達(dá)上調(diào)可能與miR-128-2基因啟動(dòng)子區(qū)高DNA甲基化及其表達(dá)沉默有關(guān)，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確子宮內(nèi)膜癌中DJ-1與miR-128-2之間是否存在反向直接調(diào)控關(guān)系，以及啟動(dòng)子區(qū)高DNA甲基化是否miR-128-2表達(dá)沉默的上游調(diào)控機(jī)制之一。