王祎祎，汪沙，段華*

作為“基底膜內(nèi)陷”致病學(xué)說的直接證據(jù)[1-2]，目前普遍認(rèn)為子宮腺肌病(adenomyosis,ADS)發(fā)生與有活性的在位內(nèi)膜向子宮肌層內(nèi)陷、生長，并異位增生、存活有關(guān)，尤其凸顯在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖與凋亡、黏附、侵襲等在ADS發(fā)生發(fā)展中的影響。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)的異常表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤、心血管、神經(jīng)內(nèi)分泌等多種人類良惡性疾病發(fā)生[3]。Hsa_circ_PVT1(circPVT1)是位于癌癥易感基因座8q24的circRNA，已有眾多研究揭示其在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸部鱗癌及急性淋巴細(xì)胞白血病等多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中過表達(dá)，以“癌基因”形式介導(dǎo)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為，與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)[4]。然而，ADS在位內(nèi)膜在一定程度上呈現(xiàn)類似惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，而circPVT1與ADS發(fā)生是否存在關(guān)聯(lián)，以及能否通過介導(dǎo)ADS內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖、侵襲進(jìn)而影響ADS的致病和表現(xiàn)，目前尚不清楚。本研究擬通過檢測circPVT1在ADS內(nèi)膜組織和細(xì)胞中的表達(dá)，分析其與ADS臨床特征的相關(guān)性，評價(jià)干擾circPVT1后ADS內(nèi)膜細(xì)胞增殖與侵襲力的變化，探討其在ADS發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年6月至2019年2月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心因ADS行全子宮切除術(shù)的45例患者入ADS組，ADS確診采用美國生育協(xié)會的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：據(jù)基底層子宮內(nèi)膜下至少一個低倍鏡(100倍)視野深處，可見子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)。同期宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ，CINⅢ)或?qū)m頸癌IA1～I(xiàn)B1期行全子宮切除的患者45例入對照組。排除內(nèi)膜病變、絕經(jīng)和(或)年齡≥50歲、術(shù)前3個月激素類藥物應(yīng)用史或?qū)m內(nèi)節(jié)育器置入史、合并嚴(yán)重內(nèi)外科疾病及盆腔炎癥性疾病、臨床病歷資料不完整者。入組病例均知情同意，本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。兩組一般情況比較詳見下頁表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RNAisoPlusRNA提取試劑盒(TaKaRa,日本),PrimeScript RT試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒(TaKaRa,日本)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone,美國)、胎牛血清FBS(BD，美國)，CCK-8(Dojindo,日本)，transwell侵襲小室(Costar,美國)，慢病毒載體目的質(zhì)粒(吉凱基因，中國上海)，lipofectamine 3000(Invitrogen，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織取材 手術(shù)室中離體子宮立即由專人無菌操作“Y”形剖開，刮取宮腔內(nèi)暴露的子宮內(nèi)膜組織5～10 g至無菌培養(yǎng)管(內(nèi)容5 mL的1%青鏈霉素的生理鹽水)用作原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離培養(yǎng)，另留取內(nèi)膜組織于-80°C凍存，用于后續(xù)總RNA提取。

1.3.2 原代子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng) 無菌PBS清洗離體子宮內(nèi)膜組織2～3遍后，組織剪剪碎至肉末狀，3～5倍體積的0.2%膠原酶I和0.005% DNA 酶振蕩消化45～60 min，100 um濾網(wǎng)過濾棄去殘?jiān)?，低速離心(760 rpm,3 min),40 um濾網(wǎng)過濾并收集濾液A，原沉淀以含10% FBS的DMEM/F12重懸獲得細(xì)胞懸液B，再次離心A和B(1 200 rpm，3 min)后棄去上清，B管沉淀重懸接種至6 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿；A管再次離心后沉淀重懸接種。置于37°C/5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%以上，1∶2消化傳代。對P1代細(xì)胞進(jìn)行電鏡或免疫熒光鑒定，確定A、B來源細(xì)胞分別為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells,ESC)和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometrium epithelial cell,EEC)。

表1 兩組患者臨床特征比較

1.3.3 qRT-PCR檢測circPVT1表達(dá) 按照試劑盒說明提取內(nèi)膜組織和細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)和合成由中國上海生工生物科技公司完成。相應(yīng)引物序列如下：目的基因circPVT1上游序列：5′-CGACTCTTCCTGGTGAAGCATCGAT-3′，目的基因circPVT1下游序列：5′-TACTTGAACGAAGCTCCATGCAGC-3′；內(nèi)參基因GAPDH上游序列：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′,內(nèi)參基因GAPDH下游序列:5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′。采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選 原代培養(yǎng)人ADS在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞(ADS_EEC)及間質(zhì)細(xì)胞(ADS_ESC)并傳代培養(yǎng)至P2。向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒載體目的質(zhì)粒sh-circPVT1及干擾陰性對照Sramble,同時(shí)每組設(shè)置正常培養(yǎng)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為完全陰性對照組NC。轉(zhuǎn)染過程為：接種ADS_EEC和ADS_ESC于不同6 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時(shí)，按照lipofectamine 3000說明書操作，次日更換培養(yǎng)基，72 h后加入1μg/μL嘌呤霉素篩選并利用qRT-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h經(jīng)篩選后以4 000個/孔密度接種于96孔板，每孔設(shè)3個復(fù)孔，置于37°C/5% CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h/48 h/72 h/96 h,更換培養(yǎng)基后每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測每孔于450 nm處吸光度(OD值)。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 以無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按1∶8稀釋基質(zhì)膠后，加入50 uL/孔于transwell上室，置于37°C培養(yǎng)箱鋪板30 min。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×105個/孔密度接種至上室，并加入200 μL無血清DMEM/F12。下室加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，以4%多聚甲醛固定下室細(xì)胞、并以0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野觀察拍照。

1.4 視覺模擬評分及月經(jīng)失血評分圖評分標(biāo)準(zhǔn)

視覺模擬評分(visual analog scale，VAS)：0分為無痛；3分以下為輕度疼痛；4～6 分為中度疼痛；7～10 分為重度疼痛。月經(jīng)失血評分圖(Pictorial blood loss assessment chart,PBAC)：根據(jù)每條衛(wèi)生巾月經(jīng)血染面積及使用衛(wèi)生巾數(shù)量來計(jì)算，面積≤整個衛(wèi)生巾1/3計(jì)為1分，1/3～3/5計(jì)為5分，大于3/5計(jì)為10分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 circPVT1在子宮腺肌病內(nèi)膜組織和細(xì)胞中的表達(dá)檢測

qRT-PCR結(jié)果顯示：與正常子宮內(nèi)膜組織(Con_En)相比，circPVT1的相對mRNA水平在ADS在位內(nèi)膜(ADS_Euc)及異位內(nèi)膜組織(ADS_Ec)中均顯著升高(P<0.001)，但ADS在位與異位內(nèi)膜組織相比，circPVT1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見下頁圖1A；circPVT1在ADS_EEC及ADS_ESC中表達(dá)水平均高于正常內(nèi)膜上皮(Con_EEC)及間質(zhì)細(xì)胞(Con_ESC)(P<0.001)，并且其在ADS_ESC中的相對表達(dá)量要高于ADS_EEC(P<0.001)，見下頁圖1B。

2.2 circPVT1表達(dá)水平與子宮腺肌病患者痛經(jīng)程度及月經(jīng)量的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：circPVT1在ADS在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平與患者PBAC評分呈中等程度正相關(guān)(r=0.539,P=0.017)；circPVT1在ADS異位內(nèi)膜的表達(dá)水平與患者痛經(jīng)程度VAS評分呈強(qiáng)正相關(guān)(r=0.614,P=0.009)。

2.3 干擾circPVT1表達(dá)后對子宮腺肌病內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞增殖力的影響

在ADS內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-circPVT1后利用qRT-PCR作干擾效率驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組(NC組)及轉(zhuǎn)染陰性對照組(Scramble組)相比，轉(zhuǎn)染sh-circPVT1后細(xì)胞內(nèi)circPVT1表達(dá)水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A。隨后CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾circPVT1表達(dá)(sh-circPVT1組)后的ADS_EEC和ADS_ESC增殖能力顯著低于未轉(zhuǎn)染組(NC組)和轉(zhuǎn)染陰性對照組(Scramble組)；NC組和Scramble組間比較，ADS_EEC及ADS_ESC細(xì)胞增殖活性均無明顯差異，見圖2B，2C；培養(yǎng)96 h后測得細(xì)胞活力百分比值在sh-circPVT1組顯著降低，見圖2D。

A．circPVT1在ADS和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)；B.circPVT1在ADS和正常子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。****P<0.0001;***P<0.001;**P<0.01;NSP>0.05。圖1 circPVT1在子宮腺肌病內(nèi)膜組織和細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平

A.qRT-PCR檢測ADS_EEC及ADS_ESC細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sh-circPVT1后circPVT1表達(dá)水平，行轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證；B．干擾circPVT1表達(dá)后ADS_EEC增殖OD值；C.干擾circPVT1表達(dá)后ADS_ESC增殖OD值；****P<0.0001;***P<0.001;**P<0.01;NSP>0.05。圖2 干擾circPVT1后子宮腺肌病內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時(shí)間OD值(CCK8)及 96 h后細(xì)胞活力檢測

2.4 干擾circPVT1表達(dá)后對子宮腺肌病內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞侵襲力的影響

Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染circPVT1陰性對照組(Scramble組)相比，干擾組(sh-circPVT1組)侵襲穿透至下室的ADS_EEC顯著減少，提示干擾circPVT1表達(dá)后ADS_EEC侵襲能力減弱，見圖3A、3B(見彩插1)；類似地，干擾circPVT1表達(dá)后，ADS_ESC在sh-circPVT1組的侵襲能力較Scramble組亦顯著降低，見圖3C、3D(見彩插1)。

3 討論

3.1 子宮腺肌病發(fā)生與在位內(nèi)膜組織和細(xì)胞異常生物學(xué)行為改變

ADS的發(fā)生機(jī)制至今尚未完全闡明，目前普遍支持由有活性的在位子宮內(nèi)膜向肌層內(nèi)陷、侵襲生長，并異位增殖導(dǎo)致腺肌病發(fā)生，是為ADS本質(zhì)。近年來，隨著對ADS在位內(nèi)膜參與ADS致病機(jī)理研究的拓展和深入，發(fā)現(xiàn)ADS在位內(nèi)膜存在諸多分子和代謝異常，尤其突出表現(xiàn)為內(nèi)膜細(xì)胞增殖力強(qiáng)化、凋亡抵抗明顯，即認(rèn)為在位內(nèi)膜細(xì)胞異常的增殖、凋亡是后續(xù)諸多生物學(xué)行為改變的基礎(chǔ)和前提[5-6]。大量研究證實(shí)，促進(jìn)ADS在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，可能誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜向肌層異位種植的發(fā)生，并且細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)的凋亡相關(guān)基因GRIM-19可通過抑制STAT3磷酸化誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)合成，促進(jìn)內(nèi)膜組織中生成新生血管，進(jìn)一步為ADS病灶的異位存活、生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。另一方面，在位內(nèi)膜細(xì)胞的局部黏附、遷移、侵襲能力增強(qiáng)則是ADS內(nèi)膜向子宮肌層浸潤生長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本課題組前期研究顯示局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)在ADS內(nèi)膜組織和細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，并進(jìn)一步揭示其可能通過增強(qiáng)在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的侵襲力參與ADS發(fā)生[8-9]。

3.2 環(huán)狀RNA介導(dǎo)子宮腺肌病在位內(nèi)膜致病機(jī)理的潛在可能

circRNA為缺乏5’3’末端的連續(xù)共價(jià)閉環(huán)，80%以上來源于基因反向剪接的外顯子。由于其環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)的可靠穩(wěn)定性、豐度高、種類多、時(shí)空特異性表達(dá)、序列高度保守等特性[10-11]，使其在RNA研究領(lǐng)域顯出獨(dú)有優(yōu)勢。在婦科領(lǐng)域，circRNA與多種女性生殖系統(tǒng)疾病關(guān)聯(lián)密切[12]，包括：與宮頸癌HPV感染致病相關(guān)、通過miRNA-靶基因軸調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為、影響宮頸癌細(xì)胞的放療抵抗過程；介導(dǎo)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)調(diào)控、作為卵巢癌預(yù)后的評估指標(biāo)；參與子宮內(nèi)膜癌的早期診斷；以及作用子宮內(nèi)膜蛻膜化過程、改變內(nèi)膜容受性、介導(dǎo)女性不孕癥發(fā)生等。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosos,EMs)中初步構(gòu)建了circRNA差異化表達(dá)模式及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并分析EMs內(nèi)膜中表達(dá)失調(diào)的circ_103470、circ_101102等通過mTOR 、Hippo、HIF-1等多條信號通路影響EMs發(fā)生[13-15]。ADS在發(fā)病機(jī)制和疾病特點(diǎn)等方面與EMs存在共通之處，但circRNA與ADS病因病機(jī)的相關(guān)研究罕有報(bào)道。本研究利用qRT-PCR技術(shù)揭示了circPVT1在ADS與正常子宮內(nèi)膜組織和細(xì)胞中的差異化表達(dá)模式，并進(jìn)一步分析提示ADS內(nèi)膜中高表達(dá)的circPVT1與患者典型臨床特征痛經(jīng)程度、月經(jīng)量異常密切相關(guān)，結(jié)果初步表明環(huán)狀RNA這一類非編碼家族新成員可能介導(dǎo)ADS的致病機(jī)理，并影響疾病進(jìn)展或轉(zhuǎn)歸的潛在可能。

3.3 干擾circPVT1表達(dá)可抑制子宮腺肌病在位內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖與侵襲

CircPVT1是源自漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1(plasmacytoma variant translocation,PVT1)的外顯子-2剪接形成的環(huán)狀RNA，在胃癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、頭頸部鱗癌、淋巴細(xì)胞白血病等多種人類惡性腫瘤組織中表達(dá)升高，發(fā)揮“癌基因”作用，通過靶向多種miRNA介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞異常增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，其本身的轉(zhuǎn)錄合成可受經(jīng)典的TP53-YAP-TEAD復(fù)合體靶向正調(diào)節(jié)[16-18]。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在ADS中呈現(xiàn)異常表達(dá)的miR-let7b也被證實(shí)可受circPVT1負(fù)調(diào)控，介導(dǎo)衰老抑制因子表達(dá)，延緩細(xì)胞衰老與凋亡[19-20]。本研究在對circPVT1組織表達(dá)水平檢測的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用體外培養(yǎng)的人ADS在位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞，對細(xì)胞內(nèi)的circPVT1表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示ADS內(nèi)膜細(xì)胞的增殖明顯受抑，侵襲力也顯著降低，提示circPVT1可在體外調(diào)控ADS在位內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖與侵襲，這可能是其介導(dǎo)子宮內(nèi)膜向肌層浸潤、增生及異位存活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，環(huán)狀RNA circPVT1在ADS內(nèi)膜組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平均升高，可能通過介導(dǎo)ADS在位內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細(xì)胞異常增殖、侵襲參與ADS致病機(jī)制，并與ADS患者的痛經(jīng)程度和月經(jīng)量改變等臨床特征密切相關(guān)，因而有可能成為ADS診斷的新型標(biāo)志物和潛在干預(yù)靶標(biāo)。但是，ADS的發(fā)生是涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，有關(guān)circPVT1在ADS疾病進(jìn)程中的確切作用和具體機(jī)制仍需更多的后續(xù)研究闡明。