楊 蓉， 莊小禹， 李修龍， 賈益群， 陳 龍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

芍藥甘草湯出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治上》，由白芍和炙甘草組成[1]，方中白芍酸寒，善于柔肝止痛[2]；炙甘草味甘，補(bǔ)中滋養(yǎng)[3]，兩者合用，酸甘化陰[4]，收澀緩急，可調(diào)和肝脾，增強(qiáng)藥效。目前，芍藥甘草湯對胃腸道疾病[5-6]、肌肉痙攣[7-9]等疾病都發(fā)揮了很好的治療作用[10]，發(fā)展前景可觀，故對其進(jìn)行質(zhì)量控制十分必要。

目前，已有學(xué)者用液相色譜[11](HPLC-PDA)、超高效液相色譜[12](UPLC-PDA)法測定了芍藥甘草湯中的多種成分，但鮮有應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[13]，而且僅測定3種成分，檢測時(shí)間較長，未體現(xiàn)液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)越性。因此，本研究建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測定芍藥甘草湯中芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、甘草苷、槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚的含量，以期為該方質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 AB SCIEX 6500 Qtrap 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；FA2004N子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；YD-B35A、B35B中藥煎煮紫砂鍋(唯雅電器有限公司)；DKZ-2恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；1730R冷凍高速離心機(jī)(德國基因公司)；QT-1 旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；Milli-Q 純水機(jī)(默瑞生物科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 白芍(產(chǎn)地安徽亳州，批號(hào)200331)購自亳州市永剛飲片廠有限公司；白芍(產(chǎn)地四川峨眉山，批號(hào)200525)購自通化市同福參茸制品有限公司；炙甘草(產(chǎn)地內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟，批號(hào)200101)購自安徽道源堂中藥飲片有限公司；炙甘草(產(chǎn)地甘肅定西，批號(hào)200507)購自亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院崔亞君副教授鑒定為正品。芍藥苷(批號(hào)MUST-19110118)、芒柄花黃素(批號(hào)MUST-20033005)、甘草查爾酮A(批號(hào)MUST-20051004)、甘草苷(批號(hào)MUST-20033010)、山柰酚(批號(hào)MUST-19091818)對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均大于98%；槲皮素(批號(hào)MB2127)、異鼠李素(批號(hào)MB7027)、柚皮素(批號(hào)MB1936)對照品均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、甘草苷、槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚對照品適量，甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為1.0、0.9、1.2、0.8、1.5、1.0、1.6、1.2 mg/mL的貯備液，精密吸取適量，甲醇定容，即得(質(zhì)量濃度分別為500、450、600、400、150、50、800、600 ng/mL)。

2.1.2 供試品溶液 稱取甘草(炙)、白芍各62 g，加600 mL水浸泡30 min，置于中藥煎煮紫砂鍋中，先武火再文火煎煮至300 mL，紗布濾過，置于4 ℃冰箱中保存，平行4份，批號(hào)分別為200717、200718、200719、200720。取水提液1 mL，置于15 mL離心管中，加入10 mL甲醇超聲(功率475 W、頻率53 kHz)處理30 min，靜置20 min冷卻，藥渣沉淀后與提取液分離，取適量濾液，14 000 r/min、4 ℃下離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得，置于-20 ℃冰箱中保存。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相水(含0.1%甲酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，95%A；1～5 min，95%～50%A；5～8 min，50%～20%A；8～9.10 min，20%～95%A；9.10～10 min，95%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；樣品溫度8 ℃；總運(yùn)行時(shí)間10 min；進(jìn)樣量4 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)；鞘氣、輔助氣氮?dú)?；離子源溫度500 ℃；離子噴霧電壓5 500 V；噴霧氣(GS1)、輔助氣(GS2)60 psi(1 psi=6.895 kPa)；多反應(yīng)檢測(MRM)模式；芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A為正離子模式，甘草苷、槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚為負(fù)離子模式，主要質(zhì)譜參數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

表1 各成分主要質(zhì)譜參數(shù)

1.芍藥苷 2.芒柄花黃素 3.甘草查爾酮A 4.甘草苷 5.槲皮素 6.異鼠李素 7.柚皮素 8.山柰酚

2.3 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液，甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度，各取1 mL，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，以S/N=10為定量限，S/N=3為檢測限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 各成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6次，測得芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、甘草苷、槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚峰面積RSD分別為0.99%、1.04%、0.45%、0.74%、0.80%、1.10%、0.28%、0.77%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取湯劑(批號(hào)200717)適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、甘草苷、槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚峰面積RSD分別為0.59%、0.28%、1.15%、1.01%、0.76%、0.85%、0.81%、0.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取湯劑(批號(hào)200717)適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫于0、3、6、12、24 h在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、甘草苷、槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚峰面積RSD分別為1.16%、1.20%、1.10%、1.31%、0.74%、1.13%、1.71%、0.76%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的湯劑0.5 mL，平行9份，分別按50%、100%、150%水平加入“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，芍藥苷平均加樣回收率為100.72%，RSD為1.33%；芒柄花黃素平均加樣回收率為100.53%，RSD為1.23%；甘草查爾酮A平均加樣回收率為100.81%，RSD為2.90%；甘草苷平均加樣回收率為98.5%，RSD為2.11%；槲皮素平均加樣回收率為99.98%，RSD為2.37%；異鼠李素平均加樣回收率為100.82%，RSD為2.77%；柚皮素平均加樣回收率為100.00%，RSD為2.07%、山柰酚平均加樣回收率為102.07%，RSD為2.41%。

2.8 樣品含量測定 取4批湯劑(批號(hào)200717、200718、200719、200720)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，平行3次，取平均值，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果(μg/mL，n=3)

3 討論

3.1 檢測方法選擇 UPLC-MS/MS的最低檢出限能達(dá)到0.012 ng/mL，可用于含量較低的化合物檢測，而且分析1個(gè)樣品僅需10 min，高效快捷。另外，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)使保留時(shí)間非常接近的化合物互不影響，準(zhǔn)確分離，從而減輕了工作量[14]，提高了效率。

3.2 色譜柱選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了Thermo Hypersil GOLD C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH Phenyl(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，發(fā)現(xiàn)ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離效果較好。

3.3 流動(dòng)相選擇 由于乙腈洗脫力高于甲醇，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為有機(jī)相。再考察了流動(dòng)相乙腈-水、乙腈-水(含0.1%甲酸)、乙腈-10 mmol/L甲酸銨-水(含0.1%甲酸)[15]，發(fā)現(xiàn)加入甲酸可改善峰形，提高離子化效率，保證較高的質(zhì)譜響應(yīng)，并且同時(shí)加入甲酸銨、甲酸后峰形與只加入甲酸相比差別不大。為了減少對色譜柱的損耗，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相。

3.4 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了溶劑甲醇、80%甲醇、60%甲醇、30%甲醇及時(shí)間15、20、30、40 min，發(fā)現(xiàn)甲醇提取30 min時(shí)效果最優(yōu)。

3.5 質(zhì)譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)對8種成分進(jìn)行了正、負(fù)離子掃描，發(fā)現(xiàn)芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A在正離子模式下響應(yīng)較強(qiáng)，槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚在負(fù)離子模式下響應(yīng)較強(qiáng)，甘草苷在2種離子模式下均有較強(qiáng)響應(yīng)，故對其進(jìn)行雙模式監(jiān)測。結(jié)果，在正離子模式下甘草苷出峰情況、峰形都不穩(wěn)定，而在負(fù)離子模式下兩者均較穩(wěn)定，故選擇負(fù)離子模式作為該成分的最優(yōu)監(jiān)測模式。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)測定芍藥甘草湯中芍藥苷、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、甘草苷、槲皮素、異鼠李素、柚皮素、山柰酚的含量，該方法分離效果良好，方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果理想，可為該方質(zhì)量控制提供準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的方法，同時(shí)也為其進(jìn)一步基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考。