何世新， 張 華， 牟臘梅， 熊學(xué)慶， 陽文武*， 周 濃

(1.重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120)

大葉茜草為茜草科茜草屬植物大葉茜草RubiaschumannianaPritz.的干燥根莖，又名土茜草、川茜草、西南茜草，1987年版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》原名“茜草”，為了與《中國藥典》收載的茜草相區(qū)別，故更名為“大葉茜草”[1]，生長于海拔1 300～3 000 m處的山谷、山坡、路邊林中或灌叢，主產(chǎn)于四川、云南、貴州、重慶等地，其性寒，味苦，歸肝經(jīng)，用于治療吐血、衄血、崩漏出血、外傷出血、經(jīng)閉瘀阻、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛等疾病[2]，主要成分為蒽醌及其苷類、萘醌及其苷類、環(huán)己肽類化合物[3-4]，具有抗炎、抗腫瘤、解熱、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理作用，對(duì)心血管系統(tǒng)也有影響，藥用價(jià)值很高[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)參照2015年版《中國藥典》四部通則項(xiàng)下規(guī)定，對(duì)來自四川、重慶、貴州、云南的8批大葉茜草中水分、總灰分、酸不溶性灰分進(jìn)行測(cè)定[6]，HPLC法測(cè)定大葉茜草素含量，微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定重金屬[鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、銅(Cu)]含量，以期為該藥材質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

ICAP-Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；AB204S型天平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；MARS6型微波消解儀(美國CEM公司)；KH-2000DB型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；ED53型干燥箱(德國Binder公司)；SDLA-B-1101型超純水機(jī)(重慶圣德利醫(yī)療器械研究有限公司)；SX2-5-12型電阻爐(重慶新特電爐設(shè)備廠)；HH-6型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。Pb、Cd、Hg、As、Cu標(biāo)準(zhǔn)貯備液質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL(國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)分別為GSB04-1742-2004、GSB04-1721-2004、GSB04-1729-2004、GSB04-1714-2004、GSB04-1725-2004)。大葉茜草素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110884-200604)。優(yōu)質(zhì)級(jí)硝酸(臺(tái)灣聯(lián)仕電子化學(xué)材料股份有限公司)；鹽酸(成都科龍化工試劑廠)；甲醇為色譜純(德國Merck公司)；水為超純水；載氣為99.99%高純氬氣。重金屬含量測(cè)定所用玻璃儀器、容器在使用前，均先用20%硝酸浸泡24 h，再用超純水洗凈。大葉茜草采自四川、重慶、貴州、云南，經(jīng)重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所張德偉副主任中藥師鑒定為大葉茜草RubiaschumannianaPritz.的干燥根莖，清洗后35 ℃下烘干，粉碎過篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 重金屬含量測(cè)定

2.1.1 分析條件 功率1.55 kW；模擬電壓-1.775 kV；進(jìn)樣泵轉(zhuǎn)速40 r/min；冷卻氣體積流量14 L/min；霧化氣體積流量1.07 mL/min；采樣深度5 mm，連續(xù)采樣3次；跳峰采集模式。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 取1 000 μg/mL Pb、Cd、As、Cu單標(biāo)溶液適量，10%硝酸稀釋成每1 mL含Pb、As 1、5、10、20、40 ng，Cd 0.5、2.5、5、10、20 ng，Cu 50、100、200、400、500 ng的溶液。另取1 000 μg/mL Hg單標(biāo)溶液適量，10%硝酸稀釋成每1 mL含Hg 0.2、0.5、1、1.5、2.0 ng的溶液，隨行試劑為空白，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以重金屬質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各重金屬在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各重金屬線性關(guān)系

2.1.3 供試品溶液制備 取藥材約0.3 g，精密稱定，置于聚四氟乙烯消解罐中，加5 mL硝酸混勻，蓋上內(nèi)蓋，旋緊外套，在微波消解爐中消解，程序見表2。消解完全后，用水轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入金標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)200 μL，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

表2 微波消解程序

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度、重復(fù)性試驗(yàn) 取Pb、Cd、Hg、As、Cu中間治療濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各重金屬峰面積RSD分別為0.82%、0.93%、1.2%、0.91%、0.64%，表明儀器精密度良好。取藥材(S3)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各重金屬含量RSD分別為0.93%、0.82%、1.1%、0.83%、0.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.2 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取藥材(S3)6份，每份0.3 g，精密加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各重金屬加樣回收率為86.7%～97.9%，RSD為0.90%～3.1%。

2.1.5 樣品含量測(cè)定 結(jié)果見表3。根據(jù)《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》ISO國際標(biāo)準(zhǔn)[7]，只有1批藥材中Cd含量不符合要求，其余均合格；在2015年版《中國藥典》限量值標(biāo)準(zhǔn)下[8]，Pb、Cd超標(biāo)率分別為12.5%、100%，而Hg、As、Cu 均符合要求。

表3 各重金屬含量測(cè)定結(jié)果

2.2 水分測(cè)定 參照2015年版《中國藥典》四部[6]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

2.3 總灰分測(cè)定 參照2015年版《中國藥典》四部[6]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

2.4 酸不溶性灰分測(cè)定 參照2015年版《中國藥典》四部[6]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 水分、總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定結(jié)果

2.5 大葉茜草素含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-水(80∶20)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長250 nm；進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，大葉茜草素的保留時(shí)間為28.702 min，色譜峰分離度良好，見圖1。

圖1 大葉茜草素色譜圖

2.5.2 對(duì)照品溶液制備與線性關(guān)系考察 精密稱取大葉茜草素對(duì)照品0.012 07 g，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.483 mg/mL對(duì)照品溶液，精密量取0.25、0.50、2.0、5.0、10.0 mL，置于20 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得0.006、0.012、0.048、0.121、0.242、0.483 mg/mL溶液。以大葉茜草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=4.744 8×107X+2.685 4×104(r=0.999 9)，在0.006～0.483 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 供試品溶液制備 取藥材(S3)粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，浸泡過夜，超聲(功率250 W、頻率33 kHz)處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 精密度、重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)得6次，測(cè)得大葉茜草素峰面積RSD為0.46%，表明儀器精密度良好。精密稱取藥材(S3)粉末6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大葉茜草素含量RSD為0.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品(S3)溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大葉茜草素峰面積RSD為0.88%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 取大葉茜草素含量已知(0.211%)的藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，精密加入標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)下樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，大葉茜草素平均加樣回收率為98.9%，RSD為0.93%。

2.5.5 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地藥材粉末各約0.5 g，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表5。

表5 大葉茜草素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的藥材重金屬含量差異較大，與李若詩等[9]報(bào)道一致；除1批藥材中Cd含量不符合《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》ISO國際標(biāo)準(zhǔn)外[7]，其余均符合規(guī)定；根據(jù)2015年版《中國藥典》限量值標(biāo)準(zhǔn)[8]，發(fā)現(xiàn)Pb、Cd超標(biāo)，以后者更明顯，是限量值的11.7倍，而Hg、As、Cu均符合相關(guān)要求，其原因可能與大葉茜草根對(duì)Cd元素的富集性相關(guān)[10]，需作進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用的微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法快速準(zhǔn)確，檢出限低，可用于大葉茜草中重金屬含量測(cè)定，從而更好地保證該藥材安全性、有效性、可控性。水分、總灰分、酸不溶性灰分是評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)，而大葉茜草素是大葉茜草主要活性成分，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8批藥材上述指標(biāo)均符合2010年版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[11]要求，其中四川西昌、涼山和重慶豐都所產(chǎn)藥材中大葉茜草素含量較高，質(zhì)量較好，可能與其在生長過程中受產(chǎn)地氣候、環(huán)境、栽培方法等因素的影響有關(guān)。在含量測(cè)定時(shí)，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)方樂敏、于瑞等[12-13]的方法，優(yōu)化了色譜條件，未將毒性較大的四氫呋喃作為流動(dòng)相，可保證安全性。另外，8批大葉茜草中幾乎都未檢出羥基茜草素，故未將其作為品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，但茜草中該成分含量較高，故可考慮將其作為辨別茜草和大葉茜草的特征成分，從而為打擊藥材混用提供新的檢測(cè)指標(biāo)。