吳海智，肖玥惠子，朱禮，袁列江，王淑霞，黃淵圓

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙410007）

牛磺酸（taurine）別名牛膽素、牛膽酸，化學(xué)式為C2H7NO3S，無(wú)臭，微酸，易溶于水[1]。?；撬岱植加趧?dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)，具有保肝利膽、抗心律失常、預(yù)防心血管疾病和提高免疫力的生理作用，能夠促進(jìn)嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育[2-4]。我國(guó)于1993年批準(zhǔn)?；撬嵩谌橹破贰胗變菏称芳肮阮?lèi)制品、強(qiáng)化飲料中添加作為功能營(yíng)養(yǎng)劑使用[5]。目前牛磺酸的測(cè)定方法主要有熒光光譜法、薄層色譜法、離子交換紫外分光光度法和高效液相色譜法[6-12]。現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.169—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y(cè)定》第二法采用丹磺酰氯柱前衍生，衍生過(guò)程操作繁瑣，耗時(shí)很長(zhǎng)且穩(wěn)定性較差，樣品在冷藏條件下僅能保存2d[13]。本研究采用程序進(jìn)樣的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)乳制品?；撬徇M(jìn)行快速測(cè)定，利用自動(dòng)進(jìn)樣器完成衍生，衍生化試劑使用量小，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，減少了人工操作產(chǎn)生的誤差，適用于乳制品中?；撬岬臏y(cè)定。

因羊乳中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等，且更利于人體消化吸收，對(duì)保護(hù)視力和快速恢復(fù)體能有很大益處[14]，市售羊乳的價(jià)格遠(yuǎn)高于牛乳。因此需要建立一種簡(jiǎn)單有效鑒別羊乳真?zhèn)蔚姆椒?，以確保羊乳制品質(zhì)量和安全[15]。?；撬崾侨撕蛣?dòng)物必需的一種氨基酸，牛奶中?；撬岷枯^低，使用牛奶喂養(yǎng)嬰幼兒相對(duì)母乳喂養(yǎng)的嬰兒發(fā)育較為遲緩，主要原因之一是牛奶中缺乏?；撬醄16]，而羊乳中含有很多容易被人體消化吸收的游離氨基酸。因此通過(guò)對(duì)羊乳、牛乳中?；撬岷窟M(jìn)行測(cè)定，來(lái)鑒別羊乳的真?zhèn)尉哂锌尚行?。本文利用程序進(jìn)樣-柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定檢測(cè)分析不同品種及地域的乳制品中?；撬岷?，探索建立以?；撬釣樘卣髦笜?biāo)的評(píng)價(jià)方法應(yīng)用于羊乳的真?zhèn)舞b別。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（包括四元汞、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、化學(xué)工作站、熒光檢測(cè)器）、ZORBAX Eclipse-AAA色譜柱：美國(guó)安捷倫公司；Q224-1CN電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Allegra 25R高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；KQ－250B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2 試劑材料

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、無(wú)水碳酸鈉（分析純）、硫酸鉀（分析純）、硼酸（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%）、月桂醇聚氧乙烯醚、2-巰基乙醇（分析純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

全脂羊奶粉、全脂牛奶粉：湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供；純羊奶、純牛奶：市售。

1.1.3 試劑的配制

亞鐵氰化鉀溶液（150 g/L）：稱(chēng)取15.0 g亞鐵氰化鉀，用去離子水溶解并定容至100 mL；乙酸鋅溶液（300 g/L）：稱(chēng)取30.0 g乙酸鋅，用去離子水溶解并定容至100 mL；流動(dòng)相A：稱(chēng)取4.78 g磷酸二氫鈉，加入1 000 mL去離子水溶解，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.8；流動(dòng)相B：移取500 mL乙腈加入500 mL甲醇，超聲混勻；硼酸-碳酸鈉緩沖溶液：稱(chēng)取碳酸鈉40.7 g，硫酸鉀18.8 g，硼酸13.57 g，加去離子水定容至1 L；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）衍生溶液：稱(chēng)取鄰苯二甲醛400 mg，加入甲醇7 mL，2-巰基乙醇1 mL，10%月桂醇聚氧乙烯醚（Brij-35）2 mL，用硼酸-碳酸鈉緩沖溶液定容至500 mL。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液10 mL，用水定容至100 mL，配制成100 μg/mL的中間液，再分別吸取一定量的中間液用水稀釋成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取固體試樣2 g，液體試樣10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加25 mL 40℃左右溫水，渦旋混勻溶解后，放入超聲波振蕩器超聲輔助提取10 min。加1.0 mL乙酸鋅溶液和1.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混合，放入50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，充分混勻。樣液于5 000 r/min下離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse-AAA（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為流動(dòng)相 A∶流動(dòng)相 B=85∶15（體積比）；流速：0.5 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)：338 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：425 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

1.2.3 自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣程序

吸?。ㄔ诠潭ㄎ恢茫?.0 μL硼酸-碳酸鈉緩沖溶液后，吸取（在指定位置）1.0 μL樣品，混合等待0.5 min；洗針，再吸?。ㄔ诠潭ㄎ恢茫?.0 μL OPA衍生溶液，洗針，吸?。ㄔ诠潭ㄎ恢茫?2 μL去離子水，混合，進(jìn)樣。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Agilent 1200高效液相色譜儀配套的色譜處理軟件完成數(shù)據(jù)采集分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft ex－cel軟件進(jìn)行整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

GB 5009.169—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中?；撬岬臏y(cè)定》第一法、第二法分別選用偏磷酸溶液（30 g/L）、水作為?；撬岬奶崛≡噭１痉椒ㄨb于?；撬針O易溶于水，選擇水作為提取試劑，試樣中牛磺酸經(jīng)水超聲輔助提取后直接上機(jī)測(cè)定。

2.2 衍生化試劑的選擇

GB 5009.169—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中?；撬岬臏y(cè)定》第二法使用丹磺酰氯為衍生化試劑，通過(guò)分別使用丹磺酰氯和鄰苯二甲醛衍生化試劑對(duì)牛磺酸進(jìn)行柱前衍生，結(jié)果為使用丹磺酰氯衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生靈敏度相對(duì)鄰苯二甲醛要低，色譜峰峰型較差，且其衍生物穩(wěn)定性較鄰苯二甲醛衍生物較差。綜合考慮，使用鄰苯二甲醛為本方法使用的衍生化試劑。

2.3 衍生方式的選擇

GB 5009.169—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中牛磺酸的測(cè)定》第二法使用人工手動(dòng)衍生的方式，該方法衍生過(guò)程比較繁瑣，而且耗時(shí)2 h以上。且衍生物穩(wěn)定性較差，樣品在冷藏條件下僅能保存2 d，對(duì)試驗(yàn)時(shí)間控制要求較高。本方法采用程序進(jìn)樣解決了?；撬嵫苌镞M(jìn)樣先后順序會(huì)影響測(cè)試結(jié)果的難題，自動(dòng)進(jìn)樣器衍生后立即自動(dòng)進(jìn)入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分析，保證了標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的衍生時(shí)間的一致性，且大大提高了工作效率，減少了人員操作而產(chǎn)生的誤差。

2.4 儀器色譜條件的選擇

本方法采用磷酸鹽緩沖液和乙腈甲醇流動(dòng)相體系對(duì)樣品中?；撬徇M(jìn)行洗脫，并對(duì)比了ZORBAX E-clipse-AAA與ZORBAX EXTEND-C18柱的分離效果，最終選用ZORBAX Eclipse-AAA色譜柱對(duì)牛磺酸進(jìn)行分離，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)性的配比及流動(dòng)相的pH值，得到的色譜圖見(jiàn)圖1～圖2。

圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of taurine standard

圖2 樣品中?；撬岬纳V圖Fig.2 Chromatogram of taurine in sample

由圖1～圖2可知，本研究選取的色譜條件取得了很好的分離度和峰形。

2.5 進(jìn)樣程序的設(shè)定

為消除不同乳制品基質(zhì)的測(cè)定影響，保證方法的通用性和適用性。進(jìn)樣程序中，加入硼酸-碳酸鈉緩沖溶液，用以調(diào)節(jié)測(cè)試液的pH值，提高了測(cè)定的穩(wěn)定性，并通過(guò)設(shè)置多次清洗進(jìn)樣針頭程序，最大程度降低了樣品間的相互干擾。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

按優(yōu)化的色譜條件，將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)試分析，通過(guò)濃度對(duì)峰面積的線性擬合得?；撬岬木€性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 The linear equation and correlation coefficient

由表 1 可知，?；撬嵩?0.5 μg/mL～50 μg/mL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》“對(duì)于確證方法，相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99”的要求。

2.6.2 精密度、回收率

在純牛奶中進(jìn)行 3 個(gè)水平（1.0、10.0、40.0mg/100g），6個(gè)平行的加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定后得到?；撬岬募訕?biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of recovery rate（n=6）

由表2可知，在本試驗(yàn)條件下，3個(gè)添加水平下?；撬岬钠骄厥章蕿?9.2%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.22%～5.25%，方法加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》要求。

2.6.3 準(zhǔn)確度

本方法與GB 5009.169—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y(cè)定》方法比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方法比對(duì)結(jié)果Table 3 The results of method comparison

由表3可知，不同方法的測(cè)試結(jié)果的相對(duì)極差均小于算術(shù)平均值的10%，表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.6.4 方法檢出限、定量限

在10 g純牛奶樣品中加入1 mL?；撬針?biāo)準(zhǔn)工作溶液（20 μg/mL），以基線10倍噪聲值為定量限在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得結(jié)果計(jì)算，測(cè)得方法定量限為0.2 mg/100 g。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)6批次的不同品牌全脂牛奶粉、6批次不同品牌全脂羊奶粉、6批次不同品牌純牛奶、6批次不同品牌純羊奶的牛磺酸含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)表 4、表 5。

表4 奶粉測(cè)定結(jié)果Table 4 Test results of milk powder

表5 液體奶測(cè)定結(jié)果Table 5 Test results of liquid milk

由表4可見(jiàn)，全脂牛奶粉?；撬岬暮糠秶鸀?.89 mg/100 g～7.42 mg/100 g，全脂羊奶粉?；撬岬暮糠秶鸀?36.6 mg/100g～60.4 mg/100 g。

由表5可見(jiàn)，純牛奶?；撬岬暮糠秶鸀?.37 mg/100 g～0.68 mg/100 g。純羊奶?；撬岬暮糠秶鸀?.20 mg/100g～6.10 mg/100 g。不同產(chǎn)地及品牌的乳制品中牛磺酸均略有差異，主要原因是泌乳動(dòng)物品種、氣候、產(chǎn)奶期以及生產(chǎn)工藝的差異。國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口乳制品中?；撬岵o(wú)明顯差異。羊乳與牛乳的結(jié)果比較見(jiàn)表6。

表6 羊乳與牛乳結(jié)果比較Table 6 The results of goat milk and cow milk comparison

從表6的數(shù)據(jù)可以看出，無(wú)論是奶粉樣品還是液體奶樣品，羊乳的?；撬峋黠@高于牛乳，其比值均≥9，差異顯著。

3 結(jié)論

本文對(duì)乳制品中?；撬岬臋z測(cè)方法進(jìn)行了研究，建立了快速高效檢測(cè)乳制品中?；撬岷康某绦蜻M(jìn)樣-柱前衍生-高效液相色譜法。試驗(yàn)結(jié)果表明，方法加標(biāo)回收率為99.2%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.22%～5.25%，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，定量限為0.2 mg/100 g。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，試劑消耗少，分析時(shí)間短，準(zhǔn)確性和精密度好，適用于乳制品中?；撬岬亩ㄐ远繖z測(cè)。本研究通過(guò)對(duì)全脂牛奶粉、全脂羊奶粉、純牛奶、純羊奶中的?；撬岷窟M(jìn)行了測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示，純羊奶中?；撬岬钠骄扛哌_(dá)4.91 mg/100 g，全脂羊奶粉中?；撬岬钠骄扛哌_(dá)47.70 mg/100 g，均為牛乳的9倍多，這就為以?；撬釣樘卣髦笜?biāo)區(qū)別牛羊乳提供了參考依據(jù)。