王 毓， 辛佳奇， 李紅網(wǎng)， 張如意，*葉 霄， 沈昱翔， 尹存平， 楊繼丞， 李松蔓

（1. 安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院， 貴州 安順 561000；2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所， 四川 成都 610300； 3. 成都醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 610500）

0 引言

滇重樓（ Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mass.） 為 黑 藥 花 科 重 樓 屬（ Paris）植物， 自然分布于我國云貴川三省[1-2]。 滇重樓是歷版《 中國藥典》 收錄著名藥用植物， 具有抗腫瘤、消腫止痛、 止血、 抗菌消炎和免疫調(diào)節(jié)等作用[1，3]，甾體皂苷是其發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[4]， 關(guān)于重樓藥材的質(zhì)量評價大多從此類物質(zhì)展開[5]。 但大多研究主要集中在重樓栽培技術(shù)與品質(zhì)評價方面， 如李海濤等人[6]研究表明不同產(chǎn)地對滇重樓品質(zhì)的影響； 楊驍、 陳翠、 何忠俊等人[7-12]研究結(jié)果表明栽培方式、 海拔、 土壤等因素對于滇重樓有效成分含量及質(zhì)量的影響； 周濃、 張靜、 等人[13-15]研究結(jié)果表明不同干燥方式對薯蕷皂苷或總皂苷的含量影響， 但目前可查文獻(xiàn)資料缺乏對于不同加工方法影響重樓皂苷I、 重樓皂苷II、 重樓皂苷VII， 以及總黃酮等有效成分含量的對比研究， 關(guān)于加工方法對于重樓品質(zhì)的相關(guān)研究報道仍不完善， 運(yùn)用凍干法對滇重樓此類成分進(jìn)行系統(tǒng)研究的報道則更為少見。 楊天梅等人[16]試驗(yàn)研究表明滇重樓沸水處理、 烘箱干燥加工總皂苷含量高于其他方法， 得出加工炮制一體化為重樓最佳加工方法的結(jié)論， 試驗(yàn)綜合前期研究，采用趁鮮切片方法處理滇重樓， 并在其烘箱干燥處理中增加了不同溫度加工處理， 且與凍干法加工數(shù)值進(jìn)行對比， 以期為滇重樓質(zhì)量研究提供參考材料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器為Agilent 1200 型高效液相色譜儀， G1314B型VWD 檢測器， Agilent Chemstation 化學(xué)工作站， 美國安捷倫公司產(chǎn)品； YTLG-10A 型真空冷凍干燥機(jī)；hh-38 型恒溫水浴鍋； Ax124ZH/E 型電子天平；UV-5200PC 型紫外可見分光光度計(jì)； 800Y 型打粉機(jī)； EPED-E3L-20TJ 型蒸餾水器等。

試藥為蒸餾水、 三氯化鋁固體、 高氯酸（70%～72%） 、 90%乙醇（ 分析純） 、 甲醇（ 分析純） 、 乙腈（ 色譜純） 、 濃硫酸（ 分析 純） 、 蒽酮（ 分析純） ，（批號20180111）， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；蘆丁對照品（ 批號R106912） ， 上海阿拉丁試劑有限公司提供； 葡萄糖對照品（ 批號G116305） ， 上海阿拉丁試劑有限公司提供； 3 種重樓皂苷對照品購自中國食品藥品鑒定研究院： 重樓皂苷I（ 批號：111590-201604） ， 重 樓 皂 苷II（ 批 號： 111591-201604）， 重樓皂苷VII（批號： 111593-20160）。

1.2 樣品來源

試驗(yàn)樣品購于安順地區(qū)種植戶， 均為為無性繁殖法栽培3 年， 經(jīng)安順學(xué)院沈昱翔副教授鑒定為黑藥花科植物滇重樓（Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.) Hand.-Mass.） 的根狀莖。 選擇大小、生長狀況接近的個體， 以保證試驗(yàn)結(jié)果的代表性。

1.3 滇重樓藥材加工方法

將選取好的滇重樓樣品的塊莖洗凈、 晾干， 去掉須根， 均切成1 cm 厚度， 混勻， 隨機(jī)分成質(zhì)量相近的6 份， 采用以下各項(xiàng)加工方法進(jìn)行干燥處理至恒重（ 見表1） ， 并計(jì)算滇重樓折干率（ 結(jié)果見表2） 。 ①自然干燥法： 將處理好的滇重樓置于室內(nèi)通風(fēng)干燥處陰干至恒定質(zhì)量（CK）； ②烘干法： 將處理好的滇重樓分別于35 ℃（ 處理代碼S1， 下同） 、 55 ℃（S2） 、 75 ℃（S3） 、 95 ℃（S4） 進(jìn)行烘干至恒質(zhì)量，得到不同溫度烘干的加工品； ③凍干法： 將處理好的滇重樓置于YTLG-10A 型真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥制得加工品（S6）。

滇重樓根狀莖不同處理方法見表1。

表1 滇重樓根狀莖不同處理方法

1.4 滇重樓藥材性狀特征及折干率評價方法

折干率計(jì)算公式為：

藥材性狀評價參照2020 年版《 中國藥典》 I 部重樓藥材標(biāo)準(zhǔn)“ 形狀” 項(xiàng)下藥材性狀進(jìn)行描述?；亓魈崛〔捎盟魇咸崛》ā?/p>

1.5 3 種特殊皂苷含量測定

測定方法參照2020 年版《 中國藥典》 I 部中重樓藥材標(biāo)準(zhǔn)里面的“ 含量測定” 對滇重樓藥材3 種特殊重樓皂苷總和含量測定。

色譜條件： 依利特C18柱（ Sinochrom ODS-BP，4.6 mm×200 mm， 5 μm） ； 檢測波長203 nm； 柱溫30 ℃； 以乙腈為流動相A， 以水為流動相B 進(jìn)行梯度 洗 脫（ 0～40 min， 30%～60%A， 70%～40%B；40～50 min， 60%～30%A， 40%～70%B） 。 檢測波長為203 nm， 進(jìn)樣量10 μL， 流速0.8 ml/min。

對照品溶液的制備： 精密稱取對照品重樓皂苷I 4.4 mg， 重樓皂苷II 4.0 mg， 重樓皂苷VII 3.9 mg， 置50 mL 量瓶中， 加甲醇制成含重樓皂苷I 0.44 mg/mL，重樓皂苷II 0.40 mg/mL， 重樓皂苷VII 0.39 mg/mL的對照品貯備液。 精密量取4 種對照品貯備液各2.5 mL置10 mL量瓶中， 搖勻， 用0.45 μm 微孔濾膜濾過即得混合對照品溶液。

制備樣品溶液并測定： 取樣品粉末約0.5 g， 精密稱量， 置具塞錐形瓶中， 精密加入乙醇25 mL， 稱定質(zhì)量， 加熱回流30 min， 放冷， 再稱定質(zhì)量用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻?yàn)V過， 即得。 分別精密吸取供試品溶液10 μL， 注入液相色譜儀， 測定， 即得。

3 種重樓皂苷線性范圍考查： 重樓皂苷I： 回歸方程為Y=335.982 2X+5.568 8， 線性范圍為0.157 0～1.569 0 μg， r=0.999 8； 重樓皂苷II： 回歸方程為Y=328.435 3X+6.231 1， 線性范圍為0.164 6～1.665 μg，r=0.999 9； 重樓皂苷VII： 回歸方程為Y=272.246 3X+5.227 9， 線性范圍為0.181 2～1.812 0 μg， r=0.999 7。

精密度試驗(yàn)： 精密吸取對照品溶液10 μL， 注入液相色譜儀， 測定峰面積， 重復(fù)6 次， 重樓皂苷I、II、 VII 的峰面積RSD 分別為0.97%， 0.99%， 0.94%（n=6）。 通過試驗(yàn)表明儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)： 取同一供試品滇重樓溶液， 室溫密閉放置， 分別在制備后0， 2， 4， 8， 12 h 分別進(jìn)樣10 μL， 測定重樓皂苷峰面積。 測得后計(jì)算重樓皂苷I、 II、 VII 峰面積RSD 分別為0.68%， 0.73%，0.49% （ n=5） 。 通過試驗(yàn)表明， 供試品溶液在12 h內(nèi)檢測對結(jié)果無影響， 供試品溶液穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)： 取同一樣品滇重樓6 份， 分別按照供試品溶液的制備方法制備， 分別進(jìn)樣10 μL， 測定峰面積， 計(jì)算含量。 重樓皂苷I、 II、 VII 含量的RSD 分別為0.62%， 0.98%， 0.79% （ n=6） 。 通過試驗(yàn)表明該方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)： 取6 份已知含量的滇重樓樣品，每份0.25 g， 精密稱定。 分別加入對照品溶液2 mL。按照供試品溶液的制備方法制備， 進(jìn)樣10 μL， 測定峰面積， 計(jì)算回收率。 重樓皂苷I、 II、 VII 的平均回收率分別為100.25%， 100.51%， 94.11%， 重樓皂苷I、 II、 VII 的回收率的RSD 分別為1.70%， 1.88%，1.44%。 試驗(yàn)表明該方法測定含量精確性較好。

1.6 總黃酮含量測定

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線： 精確稱取蘆丁對照品適量， 于25 mL 容量瓶中， 甲醇溶解定容， 得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的溶液。 取上述溶液0， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0，2.5 mL 分別于6 個10 mL 容量瓶中， AlCl3顯色劑定容， 于波長425 nm 處測吸光度， 以吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程Y=33.78X+0.026 9，R2=0.999 3。

制備樣品溶液并測定： 精確稱取樣品粉末1.5 g，圓底燒瓶內(nèi)加甲醇90 mL， 80 ℃水浴鍋中回流提取2 h， 靜置至室溫， 過濾， 重復(fù)回流一次， 過濾， 合并2 次濾液。 加熱揮發(fā)至干， 甲醇溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中， 即得樣品液。 取樣品液2 mL 于10 mL 量 瓶 中， AlCl3溶 液 定 容， 混 勻 后 于 波 長425 nm 處測吸光度， 計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.7 可溶性多糖含量測定

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線： 精確稱取葡萄糖對照品適量于25 mL 容量瓶中， 雙蒸水定容得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液。 取對照品溶液0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mL分別于6 個10 mL 具塞試管中， 加蒸餾水補(bǔ)至2 mL，置于冰水中加硫酸- 蒽酮溶液6 mL， 搖勻。 100 ℃沸水浴中顯色15 min， 冷卻后定容至刻度， 以2 mL蒸餾水重復(fù)處理作為空白對照， 于波長625 nm 處測定吸光度， 以吸光度為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到回歸方程Y=14.965X+0.145 4， R2=0.999 6。

制備樣品溶液并測定： 精確稱取樣品粉末0.5 g，于已烘干錐形瓶中， 加12 mL 蒸餾水， 加6 mol/L HCl 溶液10 mL， 100 ℃水浴30 min， 玻棒攪勻， 冷卻后用10%NaOH 溶液中和至中性， 定容至100 mL，過濾， 取濾液10 mL， 再次定容至100 mL 即得樣品水解液。 取樣品液1 mL， 于試管中， 冰水狀態(tài)下緩慢加入硫酸蒽酮溶液4 mL， 100 ℃下水浴10 min，冷卻后于波長625 nm 處測吸光度， 計(jì)算樣品中可溶性多糖含量。

2 結(jié)果與分析

不同干燥處理后滇重樓樣品內(nèi)有效成分含量見表2。

由表2 可知， 不同干燥處理方法對滇重樓樣品內(nèi)有效成分含量有一定影響。 對于折干率而言， 凍干法最高， 為57.86%。 其后折干率由大到小依次為35 ℃下烘干（ 折干率為46.27%） 、 75℃下烘干（ 折干率為45.65%）、 自然干燥（折干率為44.22%）、 95 ℃下烘干（ 折干率為41.66%） 、 55 ℃下烘干（ 折干率為39.33%） 。 重樓皂苷I、 II 含量及3 種特殊皂苷含量和均為趁鮮切片95 ℃烘干的樣品最高， 且隨溫度的降低而降低， 凍干法含量居中， 自然干燥法含量最低； 該結(jié)果與楊天梅等人[16]沸水處理皂苷含量最高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似， 推測可能由于高溫快速破壞滇重樓根莖中的酶， 并殺死植物細(xì)胞， 避免了有效成分的分解、 代謝， 同時使其淀粉糊化、 結(jié)晶水迅速散失， 因此皂苷含量最高。 總黃酮含量55 ℃條件下最高， 自然干燥法最低， 其余加工方法含量由大到小依次為35 ℃＞凍干法＞95 ℃＞75 ℃； 可溶性多糖含量75 ℃條件下最高， 凍干法最低。

因此， 滇重樓產(chǎn)地趁鮮切片后95 ℃快速烘干是最為方便快捷、 且藥材品質(zhì)優(yōu)良的加工方法。 但是因?yàn)楦邷睾婵荆?導(dǎo)致重樓藥材質(zhì)地呈膠質(zhì)， 與傳統(tǒng)藥材商品分級習(xí)慣不符。 建議生產(chǎn)中結(jié)合實(shí)際情況采用95 ℃快速烘干法， 可以提高重樓藥材的質(zhì)量。