馬國剛

（ 運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系， 山西 運(yùn)城 044000）

0 引言

鹽湖廣泛分布于世界各地， 是嗜鹽古菌高度集中的極端環(huán)境。 目前， 重點(diǎn)被研究的鹽湖有美國的大鹽湖、 肯尼亞的死海和Magadi 湖[1]。 我國的鹽湖主要分布在新疆維吾爾自治區(qū)、 青海省和山西運(yùn)城。很多研究表明， 鹽湖中存在的微生物多種多樣， 嗜鹽古菌就是其中一種， 其生存環(huán)境非常特殊， 必須生活在高鹽的環(huán)境中， 也因此形成了其特殊的代謝體系， 目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 很多極端嗜鹽古菌可以產(chǎn)生大量的類胡蘿卜素， 而且嗜鹽古菌生產(chǎn)類胡蘿卜素高效易操控。 這也是人們逐漸關(guān)注它的原因。

觀察發(fā)現(xiàn)到山西運(yùn)城鹽湖湖水大面積變紅， 所以從山西運(yùn)城鹽湖水樣中分離出一株嗜鹽古菌， 而它的發(fā)酵液呈渾濁紅色， 含有大量的類胡蘿卜素。猜測從其中提取出的類胡蘿卜素含量相較于其他微生物含量多， 所以對山西運(yùn)城鹽湖嗜鹽古菌產(chǎn)生的類胡蘿卜素提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株， 取自山西運(yùn)城鹽湖水樣中分離的一株嗜鹽古菌G11。

1.2 主要試劑

（1） 培養(yǎng)基。 GH 培養(yǎng)基： 0.5%酸水解酪蛋白，0.5%蛋白胨， 1%酵母粉， 0.3%檸檬酸鈉， 2%七水合硫酸鎂， 0.2%氯化鉀， 25%氯化鈉， pH 值7.5～8.0，于121 ℃條件下滅菌。

（ 2） 試劑。 無水乙醇、 丙酮、 甲醇、 石油醚，等均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原材料的準(zhǔn)備

準(zhǔn)確稱取酸水解酪蛋白、 蛋白胨、 酵母粉、 檸檬酸鈉、 七水合硫酸鎂、 氯化鉀、 氯化鈉， 緩慢加蒸餾水并定容到500 mL， 攪拌， 待液體泡沫幾乎沒有時(shí)， 調(diào)pH 值至7.5～8.0， 制成培養(yǎng)基備用。

取自山西運(yùn)城鹽湖水樣中分離的一株嗜鹽古菌G11， 甘油保存于-80 ℃的冰箱中。 取上述制備的培養(yǎng)基， 分裝到250 mL 的錐形瓶中， 按照10%的接種量將菌體接入， 溫度37 ℃， 轉(zhuǎn)速12 000 r/min， 振蕩并光照培養(yǎng)10 d， 待菌液呈紅色渾濁后， 停止。

取適量發(fā)酵液于離心管中， 4 ℃條件下， 以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 高速冷凍離心10 min， 收集管底菌體，蒸餾水潤洗， 取得菌體后備用。

1.3.2 有機(jī)溶劑的選擇

取制備得到的菌體， 選擇無水乙醇、 甲醇、 石油醚、 丙酮等作為提取劑提取類胡蘿卜素。 料液比1∶7，25 ℃下提取30 min 后， 4 ℃下， 以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min， 獲得上清色素提取液。 重復(fù)上述步驟3 次， 到菌體出現(xiàn)白色為止， 取上清液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（ 1） 不同提取時(shí)間對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。取制備得到的G11 菌體， 選用無水乙醇， 料液比1∶7， 25℃下依次浸提10， 20， 30， 40， 50 min 后，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min， 獲得上清色素提取液， 重復(fù)上述步驟3 次， 直至菌體出現(xiàn)白色為止， 取上清液。

（ 2） 不同提取溫度對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。取制備得到的G11 菌體， 選用無水乙醇， 料液比1∶7， 分別在30， 35， 40， 45， 50 ℃下提取30 min后， 于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min， 獲得上清色素提取液， 重復(fù)上述步驟3 次， 直至菌體出現(xiàn)白色為止， 取上清液。

（3） 不同提取料液比對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。取制備得到的G11 菌體， 選用無水乙醇， 料液比分別為1∶6， 1∶7， 1∶8， 1∶9， 1∶10， 于25 ℃下提取30 min 后， 于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min，獲得上清色素提取液， 重復(fù)上述步驟3 次， 直至菌體出現(xiàn)白色為止， 取上清液。

（ 4） 不同提取次數(shù)對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。取制備得到的G11 菌體， 選用無水乙醇， 料液比分別為1∶7， 于25 ℃下提取30 min 后， 于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min， 獲得上清色素提取液， 重復(fù)以上步驟分別1 次， 2 次， 3 次， 直至菌體出現(xiàn)白色為止， 取上清液。

1.3.4 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果， 以提取時(shí)間， 提取溫度和料液比等因素作為考查因素， 選用三因素三水平L9（ 34）進(jìn)行正交試驗(yàn)。 將類胡蘿卜素得率作為指標(biāo)，找出最優(yōu)因素和水平， 最終得出類胡蘿卜素得率較高的因素組合。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 類胡蘿卜素得率的測定

因?yàn)樵陬惡}卜素分子的結(jié)構(gòu)主鏈存在著大量的共軛不飽和雙鍵， 而且它的分子能夠在可見光區(qū)域內(nèi)有強(qiáng)烈的光吸收， 所以可以通過分光光度法進(jìn)行定量測定。 大多數(shù)類胡蘿卜素在可見光區(qū)域波長400～500 nm 處有吸收， 利用紫外分光光度計(jì)將色素提取液進(jìn)行吸收光譜測定[2]。

在容量瓶中稀釋色素粗提液， 將其置于比色皿中， 選擇波長為475 nm， 無水乙醇為空白， 讀取吸光度值， 記錄數(shù)據(jù)[3]。

將所得數(shù)據(jù)代入以下公式：

式中： Y——類胡蘿卜素得率， μg/g；

A——475 nm 處吸光度；

X——稀釋倍數(shù)；

V——加入的提取液體積， mL；

E——消光系數(shù)， 0.16；

M——用于提取色素的嗜鹽古菌菌體干重， g。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑的選擇

有機(jī)溶劑的選擇見圖1。

圖1 有機(jī)溶劑的選擇

由圖1 可知， 采用無水乙醇為提取溶劑時(shí)， 類胡蘿卜素得率最高； 丙酮提取產(chǎn)生的類胡蘿卜素含量與無水乙醇產(chǎn)生的相近， 石油醚提取類胡蘿卜素時(shí)， 提取率最低。這是因?yàn)樵陬惡}卜素的分子骨架上有40 個(gè)C 原子， 存在單雙鍵互相交替的共軛電子體系， 極易吸收別的分子能量， 而失去電子。 同時(shí)， 類胡蘿卜素分子屬于極性分子， 在很多有機(jī)溶劑中的溶解度較大[4-5]， 極易溶于無水乙醇與丙酮， 而比較難溶于石油醚。 無水乙醇與丙酮的提取效果不相上下， 但無水乙醇無毒， 價(jià)格比較便宜。 因此， 選擇無水乙醇作為提取劑。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同提取時(shí)間對類胡蘿卜素得率的影響

不同提取時(shí)間對類胡蘿卜素得率的影響見圖2。

圖2 不同提取時(shí)間對類胡蘿卜素得率的影響

由圖2 可知， 提取時(shí)間為10～20 min 時(shí)， 類胡蘿卜素得率減少， 可能是由于在10 min 時(shí)嗜鹽古菌的細(xì)胞壁破碎不夠完全， 類胡蘿卜素溶出較少， 還有大量色素殘留在菌體中。 隨著時(shí)間的推移， 細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)阻礙嗜鹽古菌的細(xì)胞壁破碎，導(dǎo)致類胡蘿卜素產(chǎn)量在提取時(shí)間為20 min 時(shí)到達(dá)最低， 而在提取時(shí)間為20～30 min 時(shí)， 類胡蘿卜素得率逐漸增加， 到30 min 時(shí)達(dá)到最大值， 可能是由于嗜鹽古菌的細(xì)胞壁徹底破碎， 類胡蘿卜素在有機(jī)溶劑中大量溶出， 在30～50 min 時(shí)， 類胡蘿卜素產(chǎn)量隨著時(shí)間的推移而逐漸減少， 原因是當(dāng)有機(jī)溶劑作用的時(shí)間過長時(shí)， 古菌G11 的細(xì)胞壁破碎過于完全， 細(xì)胞中蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)、 色素等隨著類胡蘿卜素的溶出而溶出， 同時(shí)類胡蘿卜素分子不穩(wěn)定， 極易被氧化降解， 導(dǎo)致類胡蘿卜素得率減少。

2.2.2 不同提取溫度對類胡蘿卜素得率的影響

不同提取溫度對類胡蘿卜素得率的影響見圖3。

圖3 不同提取溫度對類胡蘿卜素得率的影響

由圖3 可知， 低于40 ℃時(shí)， 隨著提取溫度升高， 類胡蘿卜素得率增大， 當(dāng)提取溫度達(dá)到40 ℃時(shí)， 得率最高， 這可能是因?yàn)榉肿舆\(yùn)動(dòng)速度與提取溫度呈正比， 溫度越高， 類胡蘿卜素在無水乙醇中的擴(kuò)散速率越大， 類胡蘿卜素的提取率也隨之增大。之后， 提取溫度繼續(xù)增大， 類胡蘿卜素得率又逐漸減小， 由于類胡蘿卜素分子中有很多不飽和雙鍵，隨著溫度的不斷提升， 類胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生降解， 得率降低。

2.2.3 不同料液比對類胡蘿卜素得率的影響

不同料液比對類胡蘿卜素得率的影響見圖4。

圖4 不同料液比對類胡蘿卜素得率的影響

由圖4 可知， 料液比為1∶7 時(shí)， 類胡蘿卜素得率最大， 超過1∶7 后， 料液比繼續(xù)增大， 類胡蘿卜素得率緩慢減少。 原因是細(xì)胞濃度越低， 細(xì)胞破碎效果變好， 隨著無水乙醇的增多， 嗜鹽古菌的細(xì)胞濃度被稀釋， 細(xì)胞破碎更徹底。 但料液比過低， 細(xì)胞壁破碎不夠完全， 部分色素會堆積到一起， 從而阻礙了類胡蘿卜素的擴(kuò)散， 最終影響類胡蘿卜素得率。 若料液比過大， 嗜鹽古菌產(chǎn)生的類胡蘿卜素產(chǎn)量逐漸減少， 同時(shí)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)被提取出來的可能性越大， 導(dǎo)致類胡蘿卜素色素提取液不夠純， 吸光度值下降， 得率也隨之減少。

2.2.4 不同提取次數(shù)對類胡蘿卜素得率的影響

不同提取次數(shù)對類胡蘿卜素得率的影響見圖5。

圖5 不同提取次數(shù)對類胡蘿卜素得率的影響

由圖5 可知， 提取次數(shù)與類胡蘿卜素得率呈正相關(guān)的關(guān)系。 提取一次類胡蘿卜素得率最少， 對類胡蘿卜素進(jìn)行提取的次數(shù)越多， 類胡蘿卜素得率也越高， 原因是由于對菌體進(jìn)行一次離心提取時(shí)， 并不能夠把菌體中的色素完全提取出來， 離心后的菌體沉淀物還顯紅色， 表明還有少量色素殘留在菌體中未被提取出。 然而， 提取次數(shù)越多， 所消耗的無水乙醇用量也越多， 不但浪費(fèi)也增加了成本， 所以綜合考慮， 將2 次作為最佳提取次數(shù)。

2.3 正交試驗(yàn)

從上述單因素試驗(yàn)中得出， 對類胡蘿卜素提取率影響較大的因素有提取時(shí)間、 提取溫度和提取料液比等。 所以選擇提取時(shí)間、 提取溫度和提取料液比進(jìn)行三因素三水平L9（ 34）的正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)方案見表2。

表2 正交試驗(yàn)方案

由表2 可知， 因素作用對指標(biāo)影響的主次， 即A＞C＞B， 即料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。 根據(jù)因素的主次確定了有機(jī)溶劑提取嗜鹽古菌中類胡蘿卜素的較優(yōu)工藝條件為A3C3B3。 又因?yàn)檫x取出的最優(yōu)水平A3C3B3沒有在正交表中出現(xiàn)。 因此， A3C3B3與正交表中最優(yōu)條件A1C3B3相比較， 進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

驗(yàn)證性試驗(yàn)見表3。

表3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

A3C3B3的提取條件比A1C3B3的提取條件較好。所以選用較優(yōu)水平A3C3B3。 即提取溶劑為無水乙醇，料液比1∶8， 提取時(shí)間40 min， 提取溫度50 ℃，提取次數(shù)為2 次時(shí)， 提取效果較好。

3 結(jié)論

通過有機(jī)溶劑提取法和紫外- 可見分光光度計(jì)法對山西運(yùn)城運(yùn)城鹽湖中嗜鹽古菌所產(chǎn)生的類胡蘿卜素進(jìn)行了提取， 該方法具有設(shè)備投資費(fèi)用少、 節(jié)約成本、 大批量提取可進(jìn)行回收試劑、 節(jié)約試劑、減少浪費(fèi)等優(yōu)點(diǎn)。

從單因素試驗(yàn)得出， 影響類胡蘿卜素得率的因素有提取時(shí)間、 提取溫度、 提取次數(shù)和料液比。 未達(dá)到40 min 時(shí)， 類胡蘿卜素得率與提取時(shí)間呈正相關(guān)， 當(dāng)超過40 min 后， 兩者之間又呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)； 當(dāng)提取溫度50 ℃時(shí)， 類胡蘿卜素得率先減少后增大，達(dá)到50 ℃后， 溫度與類胡蘿卜素得率呈負(fù)相關(guān)； 提取次數(shù)與類胡蘿卜素得率呈正相關(guān)， 最佳選2 次；料液比低于1∶7 時(shí)， 類胡蘿卜素得率與料液比呈正相關(guān)， 高于1∶7 時(shí)， 二者呈負(fù)相關(guān)。

從正交試驗(yàn)及驗(yàn)證性試驗(yàn)得出， 提取溶劑為無水乙醇， 料液比1∶8， 提取時(shí)間40 min， 提取溫度50 ℃， 提取次數(shù)為2 次時(shí)， 得率最大， 從極差分析中得出， 料液比（g∶mL） 對類胡蘿卜素得率影響最大， 然后是提取時(shí)間（min）， 最后是提取溫度。

有機(jī)溶劑提取法方法簡單、 操作省時(shí)、 環(huán)保節(jié)能， 消耗的提取劑用量較少， 若用于大規(guī)模生產(chǎn)，具有費(fèi)用較低、 可回收試劑、 減少浪費(fèi)、 降低成本等優(yōu)點(diǎn)， 而從嗜鹽古菌中提取類胡蘿卜素不需要考慮環(huán)境季節(jié)等因素。 試驗(yàn)提取的類胡蘿卜素為天然色素， 符合現(xiàn)階段人們對色素的要求， 所提取的色素可用于各方各面。 試驗(yàn)是從運(yùn)城鹽湖嗜鹽古菌中提取的色素， 進(jìn)一步擴(kuò)大了提取色素的研究范圍，為以后的研究提供科學(xué)依據(jù)。