錢然

摘要：脊髓損傷是一種高發(fā)病率和高死亡率的疾病，而嗅鞘細胞是脊髓神經(jīng)修復治療的一種有前途的方法，并且利用天然產(chǎn)物可以改善嗅鞘細胞移植后的功能。我們檢測了化合物Endiandrin A （End A）在神經(jīng)碎片因子的存在下，對嗅鞘細胞的影響。我們發(fā)現(xiàn)，End A（10 mM）在存在神經(jīng)碎片因子的情況下，刺激了嗅鞘細胞的增殖和遷移，證明了End A能調(diào)節(jié)嗅膠質(zhì)細胞的行為，從而改善移植后的生存、增殖和遷移，從而有利于神經(jīng)修復。

關鍵詞：脊髓損傷;EndiandrinA;嗅鞘細胞

脊髓損傷（SCI）是一種高發(fā)病率和高死亡率的疾病，會導致不可逆的軸突損傷和神經(jīng)元死亡，導致感覺和自主神經(jīng)功能的永久性缺陷，從而導致慢性癱瘓[1]。除了最初的損傷外，一系列嚴重的生理并發(fā)癥，包括腸、膀胱、呼吸和心臟的缺陷也是主要的威脅。。目前，脊髓損傷的治療仍然主要是保守性的，包括處理疼痛綜合征和感覺喪失并發(fā)癥的臨床護理。幸運的是，神經(jīng)生物學研究的進展，預示著新的關鍵型神經(jīng)保護和恢復療法，這些治療性干預可能會降低傷后護理的成本。

細胞治療是治療脊髓損傷的一種很有前途的策略，近年來，大量的動物研究表明，嗅球嗅鞘細胞（OB-OECs）和固有層嗅鞘細胞（LP-OECs）在神經(jīng)系統(tǒng)病理學的各個區(qū)域都能促進軸突再生。這些發(fā)現(xiàn)包括：（1）肌萎縮側索硬化（ALS）大鼠模型的神經(jīng)保護和再髓鞘化;（2）促進中風小鼠模型神經(jīng)可塑性的能力[2]和（3）神經(jīng)元碎片[3]。OECs須在移植后存活，因為OECs的增殖是至關重要的。

從早期開始，富含類黃酮的食物就被認為具有神經(jīng)保護作用，這種作用是由黃酮類化合物的抗氧化能力介導的。天然產(chǎn)物姜黃素通過增加神經(jīng)碎片因子的增殖、遷移和增強其吞噬功能而成為治療脊髓損傷的一種潛在選擇，利用天然產(chǎn)物可以改善OECs移植后的生存、遷移和增殖功能。

材料和方法：

1. 劃痕遷移試驗

嗅鞘細胞的遷移通過劃痕試驗進行測定：在劃痕試驗前，嗅鞘細胞以3x103的密度被置于96孔板上48小時，以達到70%的愈合度，之后用200μl的移液管尖端在直徑為1400至2000μm的無細胞區(qū)域劃出劃痕。用培養(yǎng)基清洗孔以去除細胞碎片，并在含有1%HEPES的DMEM/F12中培養(yǎng)12小時，在0到12小時之間，每間隔15分鐘拍攝劃痕。

2. 活細胞成像

所有的形態(tài)學分析、劃痕遷移實驗和單細胞遷移實驗都是用生命細胞成像技術來進行的。OECs在含有1%HEPES的DMEM/F12培養(yǎng)基中生長，并且圖像是在定制的37°C的溫室里，不含有二氧化碳的環(huán)境下自動采集的。在Olympus IX81 Cell R顯微鏡上使用Hamamatsu數(shù)碼相機，每10分鐘獲得一次12到36小時的熒光和微分干涉對比圖像。為了分析活細胞成像動態(tài)圖，活細胞成像實驗的延時記錄作為圖像系列輸出，并使用ImageJ進行手動分析。

結果：

與對照組相比，神經(jīng)碎片因子分別在12、24、36和48小時時抑制了OEC的遷移（圖1），但是，End A在濃度為10μM時，可使傷口愈合率提高68%左右。有趣的是，在有神經(jīng)碎片因子存在的情況下，End A的遷移率能增加約55%（圖1）。此外，延時圖像表明，治療組劃痕間隙處的神經(jīng)碎片因子數(shù)量減少，提示End A可能會吞噬神經(jīng)碎片因子。

討論：

我們使用延時顯微鏡觀察了End A對OEC遷移的影響（圖2），細胞運動很明顯受到鄰近細胞存在的影響。因此，我們用劃痕試驗檢測了單個嗅鞘細胞的遷移，使細胞遷移到無細胞劃痕中，圖像顯示，細胞并沒有沿著直線遷移到劃痕處，而是沿著一條曲折的路線遷移。為了分析活細胞成像圖像，我們將活細胞成像實驗的延時記錄導出為一個圖像序列，并使用圖像J進行手動分析，以確定其空間面積，結果發(fā)現(xiàn)End A和神經(jīng)碎片因子聯(lián)合應用顯著增加了細胞遷移到劃痕處的距離[4]。通過使用聯(lián)合應用End A和神經(jīng)碎片因子，OECs的生存能力可以顯著提高，并可能促進移植后OECs的遷移和增殖，對脊髓損傷有治療幫助。

參考文獻：

1. Leal-Filho， M.B.， Spinal cord injury： From inflammation to glial scar. Surg Neurol Int， 2011. 2： p. 112.

2. Katoh， H.， et al.， The dual origin of the peripheral olfactory system： placode and neural crest. Mol Brain， 2011. 4： p. 34.

3. He， B.R.， et al.， Phagocytic removal of neuronal debris by olfactory ensheathing cells enhances neuronal survival and neurite outgrowth via p38MAPK activity. Mol Neurobiol， 2014. 49（3）： p. 1501-12.

4. Kuntzsch， D.， et al.， The plant-derived glucocorticoid receptor agonist Endiandrin A acts as co-stimulator of colonic epithelial sodium channels （ENaC） via SGK-1 and MAPKs. PLoS One， 2012. 7（11）： p. e49426.