劉 萍，楊麥巧，楊也天，王一婷，劉麗麗，馬元平，王 芳，何 川

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院麻醉科，云南昆明 650051；2.昆明醫(yī)科大學(xué)影像系，云南昆明 650500）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease,CHD）是新生兒最為常見的先天畸形之一，發(fā)病率占全部活產(chǎn)嬰兒的7%～8%，是導(dǎo)致人類孕期流產(chǎn)、死胎和新生兒發(fā)育缺陷甚至死亡的主要原因之一[1]。心臟胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能改變所致的心臟發(fā)育異常是CHD的始動環(huán)節(jié)[2]。心臟發(fā)育涉及許多相關(guān)基因和多條信號通路，精確調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和分化，其中任意基因的異常所引起的心臟發(fā)育受損都有可能導(dǎo)致CHD的發(fā)生[2]。非編碼微小RNA（microRNA、miRNAs）被 報 道 可 通 過 促 進(jìn)mRNA降解或阻斷蛋白質(zhì)翻譯，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。近期多項研究表明，miRNAs廣泛參與到細(xì)胞代謝、增殖和凋亡等的調(diào)節(jié)過程[3]，與心臟發(fā)育、心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。例如，miR-34a通過調(diào)節(jié)Notch通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與心臟發(fā)育調(diào)控，增加了小鼠CHD風(fēng)險[6]。miR-29c也被報道調(diào)控P19細(xì)胞的生物學(xué)行為，與CHD發(fā)生相關(guān)[7]。miR-29b-3p被報道在CHD患者血清中異常低表達(dá)[8]，但對于miR-29b-3p在CHD的作用機(jī)制未見報道。本研究旨在進(jìn)一步研究CHD的發(fā)病和調(diào)控過程中miR-29b-3p的作用和分子機(jī)制，為探尋新的診斷標(biāo)志物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑P19細(xì)胞購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection,ATCC），Taq?Man MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Life Technology公司；CCK-8試劑盒購自上海麒盟生物科技有限公司；Lipofactamine 3000、Trizol提取試劑盒、GeneTai?lor Site-Directed Mutagenesis System購自美國Invit?rogen公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、青霉素、鏈霉素、2.5 mL/L胰酶購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）購自美國Sigma公司；兔抗鼠cTnT、Mef2c、GATA 4抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自英國Abcam公司；miR-29b-3p mimic、miR-29b-3p inhibitor、pc-PTEN購自上海吉瑪公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海碧云天公司；Dual-Luciferase Reporter System購自美國GeneCopoeia公司。

1.2 臨床樣本選擇2019年6月至2020年2月就診于本院心外科的24例先天性心臟病患兒，年齡1～8歲，男女各12例；對照組為24例年齡相仿的健康兒童，分別采集2組研究對象的外周血5 mL。先天性心臟病患者包括房間隔缺損11例、室間隔缺損10例、法洛四聯(lián)癥2例、動脈導(dǎo)管未閉1例，均具有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)過體檢、心電圖及心臟彩超診斷，并經(jīng)外科手術(shù)證實為先天性心臟病。本研究經(jīng)過本院倫理委員會的批準(zhǔn)，研究對象均已簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)將P19細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的α-MEM完全培養(yǎng)基中，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換新鮮培養(yǎng)液，根據(jù)細(xì)胞生長情況用胰酶消化傳代。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期P19細(xì)胞胰酶消化后，以3×105/孔密度接種于六孔板中，用無抗生素的α-MEM完全培養(yǎng)基，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細(xì)胞融合度至60%～70%。參照操作說明用Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染miR-29b-3p mimic、miR-29b-3p inhibitor、pc-PTEN至P19細(xì)胞，孵育6～8 h后，更換為含抗生素的α-MEM完全培養(yǎng)基，RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.5 RT-qPCR檢測miR-29b-3p的表達(dá)Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，取2μL RNA用NanoDrop2000核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，并分裝保存于?80℃。TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成為cDNA。上樣至PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)。miR-29b-3p引物序列為Forward:TAGCAC?CATTTGAAATCAGTGTT；Reverse:CTGGTTTCA?CATGGTGGC。U6引物序列為Forward:CGCTTC?GGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC；Reverse:GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTGC。結(jié)果采用2-ΔΔCT法，以U 6為內(nèi)參計算miR-29b-3p的相對表達(dá)量。

1.6 DMSO誘導(dǎo)心肌樣分化用2.5 mL/L胰酶消化細(xì)胞轉(zhuǎn)染后正常貼壁培養(yǎng)的P19細(xì)胞，以5×105～7×105/mL密度接種于10 cm含誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10 mL/L DMSO、100 mL/L FBS、100 mg/L鏈霉素和100 U/mL青霉素的α-MEM完全培養(yǎng)基）的Petri細(xì)菌培養(yǎng)皿，置于37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)至第8天，收集心肌樣細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測。

1.7 CCK-8檢測細(xì)胞增殖取P19細(xì)胞胰酶消化離心，分別收集各組細(xì)胞制備成濃度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，每孔200μL接種于96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，做好標(biāo)記。于37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。每隔24 h進(jìn)行CCK-8檢測：每孔加入CCK-8試劑10μL混勻，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度值。

1.8 Transwell檢測細(xì)胞遷移取P19樣細(xì)胞消化，制成濃度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，在Transwell上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入含100 mL/L FBS的α-MEM培養(yǎng)基，每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔，置于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出小室。輕輕用棉簽拭除上室細(xì)胞，遷移到下室的細(xì)胞用40 g/L多聚甲醛固定15 min，然后結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察并拍攝照片。

1.9 Westernblotting檢測蛋白水平誘導(dǎo)10 d后，按照蛋白提取試劑盒操作說明提取心肌樣細(xì)胞的總蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸5 min。取等量的蛋白用100 g/L的分離膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束之后，在冰浴下轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜2 h。50 g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉90 min，以兔抗人cTnT、Mef2c和GATA 4抗體作為一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min。接著加羊抗兔二抗，37℃孵育90 min，TBST清洗3次，每次10 min。于暗室中采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影定影，Image J分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參。P19細(xì)胞PTEN水平檢測同上。

1.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸TEN 3′UTR序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物連接到p GL 3質(zhì)粒XbaⅠ酶切位點構(gòu)建野生型WT報告基因質(zhì)粒。采用Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System試劑盒，突變PTEN 3′UTR上結(jié)合位點，構(gòu)建突變型MUT報告基因質(zhì)粒。將空載體、miR-29b-3p mimic、WT和MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期293T細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，按照Dual-Luciferase Reporter System說明檢測熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗均設(shè)置3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)用生物統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-29b-3p在CHD患者外周血清中和心肌分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下的表達(dá)情況RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-29b-3p在CHD患者外周血清中的水平顯著低于健康對照組（t=5.083，P=0.001，圖1A），且在心肌分化誘導(dǎo)劑DMSO誘導(dǎo)下，miR-29b-3p表達(dá)水平上調(diào)，第8、第12、第16天與對照組相比誘導(dǎo)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.883，P=0.004，圖1B）。

圖1 miR-29b-3p在CHD患者外周血清中和心肌分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下的表達(dá)情況Fig.1 The expression of miR-29b-3p in the peripheral serum of CHD patients and induced by myocardial differenti?ation inducer

2.2 敲降miR-29b-3p對心肌樣細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用RT-qPCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-29b-3p inhibitor顯著抑制了miR-29b-3p在P19細(xì)胞中的表達(dá)（t=6.380，P=0.002，圖2A）。CCK-8實驗和Transwell遷移檢測已分化心肌樣細(xì)胞的增殖和遷移，結(jié)果顯示相比對照組，敲降miR-29b-3p對心肌樣細(xì)胞的增殖和遷移均有顯著抑制作用（圖2B、圖2C和表1）。Western blotting實驗結(jié)果顯示，敲降miR-29b-3p顯著抑制心肌特化基因（cTnT、GATA 4、Mef2c）表達(dá)，miR-29b-3p inhibitor組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。誘導(dǎo)P19細(xì)胞心肌樣分化晚期miR-29b-3p表達(dá)顯著高于早期，敲降miR-29b-3p抑制P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。

表1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力Tab.1 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

表1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力Tab.1 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

與NC組比較，*P<0.05。

組別NC miR-29b-3p inhibitor時間(d)0 0.22±0.04 0.21±0.04 1 0.36±0.05 0.28±0.04 2 0.63±0.06 0.41±0.03 3 0.86±0.05 0.65±0.07 4 1.18±1.3 0.83±0.07 5 1.3±0.05 0.94±0.06*

圖2 敲降miR-29b-3p對P19細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用Fig.2 Effects of miR-29b-3p knockdown on the proliferation,migration and differentiation of P19 cells

2.3 miR-29b-3p對PTEN的靶向調(diào)控生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫StarBase預(yù)測結(jié)果顯示，miR-29b-3p和PTEN人類基因和鼠基因中有一致的保守結(jié)合位點（圖3A），雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示（圖3B），過表達(dá)miR-29b-3p顯著抑制p GL 3-PTEN-WT野生型載體的熒光素酶活性，而對突變型的載體無顯著影響。進(jìn)一步Western blotting實驗結(jié)果顯示（圖3C），過表達(dá)miR-29b-3p下調(diào)了PTEN的表達(dá)。miR-29b-3p靶向PTEN并負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

圖3 miR-29b-3p對PTEN的靶向調(diào)控Fig.3 miR-29b-3p targeted and regulated PT EN

2.4 miR-29b-3p靶向PTEN對心肌樣細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用Western blotting檢測結(jié)果顯示，相比對照組，轉(zhuǎn)染pc-PTEN引起PTEN表達(dá)顯著上調(diào)（t=6.694，P=0.002），而同時轉(zhuǎn)染pc-PTEN和miR-29b-3p mimic組PTEN蛋白水平恢復(fù)至與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4A）。倒置顯微鏡觀察DMSO誘導(dǎo)下第0～第10天中P19分化狀態(tài)，結(jié)果顯示，相比對照組，過表達(dá)PTEN顯著抑制P19細(xì)胞心肌樣分化，而同時過表達(dá)PTEN和miR-29b-3p與對照組P19細(xì)胞分化過程無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4B）。DMSO誘導(dǎo)10 d后進(jìn)行CCK-8增殖和Transwell遷移檢測，結(jié)果顯示，相比對照組，過表達(dá)PTEN顯著抑制心肌樣細(xì)胞增殖和遷移，而同時過表達(dá)PTEN和miR-29b-3p對心肌樣細(xì)胞增殖和遷移的影響與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4B、圖4C、表2）。miR-29b-3p通過負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，促進(jìn)P19細(xì)胞分化和心肌樣細(xì)胞增殖、遷移。

表2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力Tab.2 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

表2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力Tab.2 CCK-8 detected cell proliferation activity （±s）

與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01；與pc-PTEN組比較，#P<0.05。

組別NC pc-PTEN pc-PTEN+miR-29b-3p mimic時間(d)0 0.20±0.05 0.20±0.04 0.21±0.04 1 0.34±0.05 0.26±0.05 0.36±0.05 2 0.68±0.06 0.34±0.05 0.58±0.05 3 0.9±0.05 0.52±0.04 0.81±0.05 4 1.20±0.05 0.74±0.06 1.00±0.06 5 1.31±0.04 0.84±0.07*1.11±0.06#

圖4 miR-29b-3p靶向PTEN對P19細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用Fig.4 Effects of miR-29b-3p on the proliferation,migration and differentiation of P19 cells by targeting PTEN

3 討 論

心臟是胚胎發(fā)生過程中最早形成的具有形態(tài)和功能的器官，維持心臟發(fā)育穩(wěn)態(tài)是個體生存的基礎(chǔ)，涉及精確的細(xì)胞增殖、遷移分化，其中多條通路參與調(diào)控，如Wnt通路、BMP通路、AKT通路、Noctch通路等[9-10]。先天性心臟病是先天性畸形中最常見的一種，涉及心臟組織本身及大血管的畸形，造成心臟結(jié)構(gòu)或功能的病變，是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的主要原因。但大多數(shù)先天性心臟缺陷的原因仍不明確，越來越多研究顯示了表觀遺傳學(xué)在心臟發(fā)育中的重要作用，因此探究胚胎心臟形成和發(fā)育過程中的基因調(diào)控機(jī)制，可以為先天性心臟病的防治提供新思路。MicroRNA（miRNAs）是內(nèi)源性長度為20～26個核苷酸的非編碼RNA，miRNA與其靶基因的3′端非翻譯區(qū)（3′-UTR）相互作用，以促進(jìn)其mRNA降解，抑制蛋白質(zhì)翻譯，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著重要作用。miRNA可作為心臟信號通路和基因轉(zhuǎn)錄中的與環(huán)境交互的“分子開關(guān)”，通過影響時序發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞的增殖和凋亡，參與調(diào)節(jié)心臟發(fā)育和再生生

物學(xué)的各個方面[3]。在先天性心臟病中功能活躍，miR-29c抑制P19細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，過表達(dá)miR-29c導(dǎo)致斑馬魚心率減慢、心包水腫以及心臟循環(huán)障礙[7]。此外，miRNA在循環(huán)中穩(wěn)定性高，在母體、胎兒或新生兒血清中的miRNA表達(dá)譜可能成為心臟疾病診斷和預(yù)后的重要指標(biāo)[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b-3p在先天性心臟病患者外周血中異常低表達(dá)。研究報道在miR-29b-3p心力衰竭患者外周血中水平降低，miR-29b-3p已被多次報道調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12-13]。ALTAF等[8]研究顯示，miR-29b-3p在CHD患者外周血中表達(dá)較健康人群降低。P19細(xì)胞是一種在體外培養(yǎng)的多能性細(xì)胞，作為心肌細(xì)胞模型廣泛應(yīng)用于心臟發(fā)育和先天性心臟病發(fā)病機(jī)制的研究中[14]。本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性調(diào)節(jié)了P19細(xì)胞miR-29b-3p，確定了miR-29b-3p異常低表達(dá)介導(dǎo)心臟發(fā)育異常的分子機(jī)制。miR-29b-3p引起靶基因PTEN表達(dá)上調(diào)，抑制P19細(xì)胞增殖、遷移和分化。cTnT、Mef2c及GATA 4均為心肌細(xì)胞的標(biāo)志性基因，常用來鑒定心肌細(xì)胞的形成，在心肌分化功能性miRNA表達(dá)失調(diào)的情況下，該3個基因表達(dá)也會發(fā)生變化[15]。本研究Western blotting結(jié)果證實，miR-29b-3p低表達(dá)的同時阻礙了心肌分化基因的表達(dá)，阻礙其向心肌樣分化。

PTEN被廣泛報道為一個腫瘤相關(guān)基因，是PI3K/AKT通路的內(nèi)源抑制分子[16]。最新研究表明，在先天性心臟病患者中發(fā)現(xiàn)了較高的PTEN突變率[17]，并且作為miRNA的靶基因，PTEN同樣在心臟發(fā)育和心肌分化中有重要作用，GLASS等[18]研究表明，PTEN作為miR-1的靶基因調(diào)控胚胎干細(xì)胞的心肌樣分化。近年有研究發(fā)現(xiàn)，miR-301a通過靶向抑制PTEN表達(dá)，介導(dǎo)AKT通路促進(jìn)心肌分化[19]。PI3K/Akt3信號通路參與心臟缺血/再灌注損傷和心肌細(xì)胞重塑[20-21]，也通過調(diào)節(jié)心臟祖細(xì)胞增殖影響正常心臟發(fā)育[22]。生物信息學(xué)工具預(yù)測PTEN為miR-29b-3p的潛在靶基因，本研究證實P19細(xì)胞中miR-29b-3p可靶向負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)，并且進(jìn)一步的功能恢復(fù)實驗也證實，PTEN作為miR-29b-3p的下游分子，可以抑制miR-29b-3p的生物學(xué)功能，恢復(fù)P19細(xì)胞的增殖、遷移和分化水平。

綜上所述，敲降miR-29b-3p表達(dá)，可以進(jìn)而上調(diào)PTEN表達(dá)，最終抑制細(xì)胞增殖、遷移和心肌樣分化，這為闡明miR-29b-3p調(diào)控心臟發(fā)育和致胚胎心臟發(fā)育畸形的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為研究先天性心臟病的治療提供了新的思路。