郭 鏡，高 月

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院康復科，遼寧錦州 121001；2.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶 400700）

人wee1基因位于11p15.1～11p15.3，編碼含有647個氨基酸的蛋白質，是一種屬于絲氨酸/蘇氨酸家族的蛋白激酶。wee1蛋白激酶在人類多種惡性腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的各種生物學行為[1-2]。本課題組前期研究發(fā)現，wee1激酶在卵巢癌組織中高表達，沉默wee1表達能夠抑制卵巢癌細胞的增殖與侵襲轉移。華蟾素(cinobufotalin,CINO)是傳統(tǒng)中藥材蟾皮的水煎煮提取物，具有清熱、解毒、消腫、化瘀等功效，并對腫瘤具有較強的抑制作用[3-4]。文獻報道，CINO在卵巢癌中能夠抑制卵巢癌細胞的生長、促進細胞凋亡和抑制細胞侵襲轉移[5-6]，但尚未見報道其抑制作用是否與wee1的表達有關。本研究對此進行實驗觀察，以明確wee1的表達變化與CINO治療卵巢癌的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌SKOV 3細胞購自中科院上海細胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，CCK 8試劑盒購自Promega公司；pcDNA-wee1過表達載體由上海吉瑪基因公司構建。鼠抗人wee1、Bcl-2、Bax、Caspase-3單克隆抗體和兔抗鼠β-actin多克隆抗體購自Abways公司。Annexin V-FITC/PI試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 構建并鑒定轉染wee1過表達SKOV3細胞SKOV 3細胞培養(yǎng)于含100 mL/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中。按1×105/孔細胞接種于6孔板，待細胞生長達50%匯合時，按Lipofectamine 2000說明書轉染細胞。wee1過表達組轉染pcDNA-wee1過表達載體，另設無轉染組、轉染pcDNA組。

Real-time PCR檢測轉染細胞wee1的表達：轉染48 h，收集各組細胞提取總RNA并測定RNA濃度。1μg RNA為模板，按RT-PCR逆轉錄試劑盒合成cDNA；1μL cDNA為模板，進行Real-time PCR反應。Wee1基因正義鏈5'-CCACCACCCT-GCCAGT?TAA-3'，反 義 鏈5'-TAAACTTTTGT-GCAAC?CAGGGTAA-3'。反應條件：95℃10 s，95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，45個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_用2-△△CT法確定。

Western blotting檢測轉染細胞wee1的表達：轉染48 h，收集各組細胞提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。用80 g/L SDS-PAGE電泳后，將目標蛋白轉移到PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗鼠抗人wee1（1∶500稀釋），4℃孵育過夜。TBST液洗膜5次，加入二抗，室溫孵育2 h。ECL曝光并檢測蛋白表達。以β-actin作為內參，蛋白相對表達=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3 CCK8實驗檢測細胞增殖將轉染pcDNAwee1并鑒定成功過表達的SKOV 3細胞培養(yǎng)至約80%匯合，于96孔板進行分組干預，即空白對照組、CINO組（10μg/mL）、CINO+pcDNA-wee1組和pcDNAwee1組。每組設3個復孔。分別干預作用24、48、72 h，加入10μL/孔CCK 8試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標儀檢測吸光度（A）值(波長450 nm)。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率按1.3項分組干預培養(yǎng)48 h，收集細胞，用PBS緩沖液沖洗2次，離心棄掉上清，加入1 mL PBS混勻，加入5μL Annexin V-FITC振蕩混勻，4℃孵育15 min，加入5μL PI，孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，上述實驗重復3次。

1.5 Westernblotting檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達按1.3項分組干預培養(yǎng)48 h，收集細胞提取蛋白，按1.2項中實驗步驟，進行電泳，轉膜，封閉后，分別加入抗Caspase-3（1∶200）、Bcl-2（1∶500）和Bax（1∶500）4℃孵育過夜。洗膜，加入二抗，室溫孵育2 h。ECL曝光并檢測各蛋白表達。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩樣本的均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 wee1過表達SKOV3細胞的鑒定Real-time PCR結果顯示，與無轉染組和轉染pcDNA組比較，pcDNA-wee1組轉染48 h，wee1 mRNA表達明顯增高；Western blotting結果顯示，pcDNA-wee1組wee1蛋白表達明顯高于其他組(P<0.05，圖1)。

圖1 wee1過表達SKOV3細胞的mRNA（A）與蛋白（B）表達情況Fig.1 The mRNA（A）and protein（B）expressions of wee1 in SKOV 3 cells

2.2 CINO和（或）pcDNA-wee1對SKOV3細胞增殖的影響CCK 8檢測結果顯示，培養(yǎng)24、48、72 h，與空白對照組相比，pcDNA-wee1組促進SKOV 3細胞生長(P<0.05)，而CINO組SKOV 3細胞生長明顯被抑制，且均與時間呈正比(P<0.05)；與空白對照組相比，CINO+pcDNA-wee1組SKOV 3細胞生長無明顯變化(P>0.05)。而與pcDNA-wee1組相比，CINO和CINO+pcDNA-wee1組SKOV 3細胞的生長抑制，并與時間呈正比(P<0.05，圖2)。說明CINO可能是通過影響wee1表達而抑制SKOV 3細胞的生長。

圖2 CINO和（或）pcDNA-wee1對SKOV3細胞增殖的影響Fig.2 The effects of CINO and/or pcDNA-wee1 on the proliferation of SKOV 3 cells

2.3 CINO和（或）pcDNA-wee1對SKOV3細胞凋亡的影響流式細胞儀結果顯示，與空白對照組相比，pcDNA-wee1組作用48 h時SKOV 3細胞凋亡抑制(P<0.05)；而CINO組SKOV 3細胞凋亡增高(P<0.05)；CINO+pcDNA-wee1組SKOV 3細胞的凋亡情況無明顯變化(P>0.05)。與pcDNA-wee1組相比，CINO組和CINO+pcDNA-wee1組SKOV 3細胞凋亡均增高(P<0.05，圖3)，說明CINO可能是通過抑制wee1表達而促進SKOV 3細胞凋亡。

圖3CINO和（或）pcDNA-wee1對SKOV3細胞凋亡的影響Fig.3 The effects of CINO and/or pcDNA-wee1 on the cell apoptosis rate of SKOV 3 cells

2.4 CINO和（或）pcDNA-wee1對SKOV3細胞wee1表達的影響與空白對照組相比，pcDNAwee1組wee1的表達明顯增加，而CINO組wee1的表達均被抑制（P<0.05）；與空白對照組相比，CINO+pcDNA-wee1組wee1的表達無明顯變化（P>0.05)。與pcDNA-wee1組相比，CINO組和CINO+pcDNAwee1組wee1的表達均被抑制(P<0.05，圖4)。這表明CINO可抑制wee1表達。

圖4 各組細胞中wee1蛋白的表達情況Fig.4 The expression of wee1 protein on SKOV 3 cells in different groups

2.5 CINO和（或）pcDNA-wee1對Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響與空白對照組相比，CINO組Caspase-3、Bax蛋白表達上調，而Bcl-2蛋白表達下調；pcDNA-wee1組Caspase-3、Bax蛋白的表達下調，而Bcl-2蛋白表達上調(P<0.05)；CINO+pcDNAwee1組Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表達無明顯變化（P>0.05，圖5)。

圖5 各組細胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達情況Fig.5 The expressions of Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins on SKOV 3 cells

3 討 論

中藥已廣泛應用于腫瘤的臨床治療中，在抑制腫瘤發(fā)展、減輕腫瘤患者病痛、提高患者免疫功能、延長患者壽命等方面發(fā)揮重要作用[7]。CINO是干蟾皮的提取物，其主要活性成分為多肽類、蟾毒配基類、吲哚生物堿類等?！渡褶r本草經》中曾記載“蟾蜍味辛寒，主邪氣，破癥堅血、癰腫、陰瘡，服之不患熱病”，為CINO在現代醫(yī)學中應用于臨床治療腫瘤提供經典的理論依據[8]。近年來，CINO已廣泛應用于消化道腫瘤、肺癌、非霍奇金淋巴瘤等腫瘤治療中[9-11]。無論單獨使用還是與化療藥物聯(lián)合應用，均取得了良好療效。研究發(fā)現，CINO抗腫瘤分子機制主要是由死亡受體介導的外源性信號通路和線粒體參與的內源性信號通路，在多種酶和蛋白質參與下抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡[12]。本課題組前期研究發(fā)現，CINO可以抑制卵巢癌細胞的生長并促進其凋亡[13]，但具體機制尚不清楚。

人wee1基因位于11p15.1～11p15.3，編碼含有647個氨基酸的蛋白質。wee1除了在胚胎發(fā)育、神經元極化等方面發(fā)揮作用外，還調控著DNA復制、組蛋白轉錄等生物學進程，一旦這些行為異常，可導致基因組不穩(wěn)，最終引起惡性腫瘤的發(fā)生[14-16]。文獻報道，wee1蛋白激酶在胃癌、結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中高表達，干擾wee1基因能夠抑制結直腸癌細胞增殖侵襲，wee1作為一種潛在的腫瘤治療靶點已被學者關注[17-19]。本課題組前期研究發(fā)現，wee1激酶在卵巢癌組織中高表達，沉默wee1能夠抑制卵巢癌細胞的增殖與侵襲轉移。本研究明確了CINO可明顯抑制pcDNA-wee1促進卵巢癌SKOV 3細胞生長，并且這種作用具有時間依賴性，同時CINO和pcDNAwee1聯(lián)合作用時，CINO可抑制pcDNA-wee1細胞中wee1過表達而增強的作用，證實CINO能夠抑制卵巢癌SKOV 3細胞wee1的表達。

Caspase家族是細胞凋亡進程中的主要執(zhí)行者，其中Caspase-3是家族中的重要成員，在促進細胞凋亡過程中發(fā)揮關鍵的樞紐作用[20]。Bcl-2是Caspase-3的上游調控蛋白，可抑制Caspase-3的表達，進而抑制細胞凋亡，而Bax則具有促細胞凋亡的作用[21]。本研究結果提示，pcDNA-wee1可降低SKOV 3細胞凋亡，下調Caspase-3和Bax的表達，上調Bcl-2的表達；而當CINO和pcDNA-wee1聯(lián)合作用時，CINO可明顯降低pcDNA-wee1抑制SKOV 3細胞凋亡的作用，上調Caspase-3和Bax的表達，下調Bcl-2的表達。說明CINO可通過抑制wee1來增強Caspase-3和Bax的表達，降低Bcl-2的表達，進而促進卵巢癌SKOV 3細胞的凋亡。

綜上所述，本研究表明，在卵巢癌細胞中，CINO能夠抑制SKOV 3細胞增殖，誘導其凋亡，其機制可能是CINO抑制wee1的表達，進而使Bax和Caspase-3的蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達降低，啟動了內源性凋亡通路，促進細胞凋亡。這為進一步研究CINO在卵巢癌中的作用機制奠定了一定的理論基礎。