陶正貴，杜靜虎，田 葵，王東華，胡鳳琪，陳滿宇

（1.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽市中心醫(yī)院普外科，湖北襄陽441000；2.襄陽市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北襄陽441000）

胃癌是對人類危害較大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高居消化道惡性腫瘤的首位，已成為全球性重大公共衛(wèi)生問題[1]。盡管早期胃癌術(shù)后5年內(nèi)生存率可達(dá)到90%以上，但早期胃癌大多無特異性癥狀，容易被忽視，而臨床確診患者病情常已進(jìn)入中晚期，錯(cuò)失了最佳治療時(shí)機(jī)，而且此階段胃癌普遍發(fā)生轉(zhuǎn)移，目前尚缺乏療效確切的治療方法[2-3]。因此，了解胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制，進(jìn)行相關(guān)干預(yù)，對于改善胃癌患者預(yù)后有重要作用。微小RNA（micro-RNA,miRNA）是內(nèi)源性非編碼RNA，對細(xì)胞生長、凋亡和腫瘤發(fā)生等有重要調(diào)控功能，其中miRNA在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，可能起促癌或抗癌作用[4]。據(jù)報(bào)道，miR-124-3p.1作為潛在的腫瘤抑制因子，對卵巢癌、直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，可能與影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及遷移有關(guān)[5-6]。但目前miR-124-3p.1在胃癌中的相關(guān)研究較少，其與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptorassociated factor 6,TRAF6）在胃癌細(xì)胞中是否存在靶向關(guān)系尚不清楚。本研究檢測miR-124-3p.1在正常組織、細(xì)胞和胃癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)，并觀察miR-124-3p.1過表達(dá)對轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移的影響，以探索胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及臨床治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織來源采集襄陽市中心醫(yī)院2018年1月至2019年1月行胃癌切除術(shù)患者的癌組織及癌旁正常組織（距病灶2 cm），患者均經(jīng)病理診斷確診為胃癌。組織樣本經(jīng)生理鹽水洗凈后，切除壞死組織，置于?80℃保存?zhèn)溆?。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞及主要試劑人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞NCI-N87、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45購于中國生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen），miR-124-3p.1模擬物、無意義序列、空載質(zhì)粒、TRAF6的慢病毒載體由北京信生元生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供，Trizol試劑、RIPA裂解液（北京索萊寶公司），β-actin、TRAF6、上皮型鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏素（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、一抗（美國Abcam）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組以含有100 mL/L胎牛血清的高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于37℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；光鏡下觀察細(xì)胞生長匯合至80%～90%時(shí)，添加適量胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞分組分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。①觀察細(xì)胞中miR-124-3p.1、TRAF6的表達(dá)：正常培養(yǎng)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞NCI-N 87、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-124-3p.1、TRAF6 mRNA的表達(dá)。②觀察過表達(dá)miR-124-3p.1對TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲與遷移的影響：將SGC-7901細(xì)胞分為對照組（Control）、TGF-β1組、TGF-β1+無意義序列組（TGF-β1+NC）、TGF-β1+miR-124-3p.1模擬物組（TGF-β1+mimic），Control組無處理，其余組以5 ng/mL TGF-β1處理細(xì)胞24 h，再分別將無意義序列、miR-124-3p.1 mimic轉(zhuǎn)染TGF-β1+NC組和TGF-β1+mimic組細(xì)胞。③觀察過表達(dá)miR-124-3p.1靶向TRAF6對TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲與遷移的影響：將SGC-7901細(xì)胞分為TGF-β1組、TGF-β1+mimic組、TGF-β1+mimic+空載質(zhì)粒組（TGF-β1+mimic+vector）、TGF-β1+mimic+TRAF6的慢病毒載體組（TGF-β1+mimic+TRAF6）。

1.4 熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-124-3p.1、TRAF6mRNA的表達(dá)分別取適量胃癌組織及癌旁正常組織、胃癌細(xì)胞及GES-1細(xì)胞（1.3項(xiàng)中①各組細(xì)胞），經(jīng)Trizol法裂解提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板鏈，經(jīng)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)，各基因引物序列見表1。分別以U 6和GAPDH為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算組織和細(xì)胞中miR-124-3p.1和TRAF6 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

1.5 蛋白印跡法檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及TRAF6的表達(dá)分別取適量胃癌組織、癌旁正常組織 和Control組、TGF-β1組、TGF-β1+NC組、TGF-β1+mimic組、TGF-β1+mimic組、TGF-β1+mimic+vector組、TGF-β1+mimic+TRAF6組（1.3項(xiàng)中②③各組細(xì)胞）SGC-7901細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解提取總蛋白，各組取等量蛋白經(jīng)100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再于50 g/L脫脂奶粉室溫作用2 h以阻斷非特異性位點(diǎn)后，置于一抗中4℃孵育過夜（稀釋比：β-actin、TRAF6 1∶1 000，E-cadherin、N-cadherin 1∶500，Vimentin 1∶1 500），于二抗中室溫孵育1 h，最后檢測膜上的蛋白發(fā)光信號。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值，判定TRAF6、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白的相對表達(dá)。

1.6 Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力預(yù)先將稀釋過的Matrigel包被Transwell小室，以無胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Control組、TGF-β1組、TGF-β1+NC組、TGF-β1+mimic組、TGF-β1+mimic組、TGF-β1+mimic+vector組、TGF-β1+mimic+TRAF6組細(xì)胞（1.3項(xiàng)中②③各組細(xì)胞）12 h后，以5×105/mL密度接種于Transwell小室上室，下室添加含有200 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后取出Transwell小室固定，滴加結(jié)晶紫染色，拭去上層未遷移細(xì)胞后，光鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞并拍照。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力將Control組、TGF-β1組、TGF-β1+NC組、TGF-β1+mimic組、TGF-β1+mimic組、TGF-β1+mimic+vector組、TGF-β1+mimic+TRAF6組細(xì)胞（1.3項(xiàng)中②③各組細(xì)胞）以1×105/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，用1 mL移液槍頭在細(xì)胞孔中央垂直劃線，再用PBS洗去脫落細(xì)胞，拍照并測量0 h時(shí)劃痕寬度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h再次拍照，測量24 h時(shí)劃痕寬度，以劃痕“愈合”率表示細(xì)胞遷移能力，劃痕“愈合”率（%）=（0 h時(shí)劃痕寬度?24 h時(shí)劃痕寬度）/0 h時(shí)劃痕寬度×100%。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證靶向關(guān)系經(jīng)在線軟件Targetscan預(yù)測miR-124-3p.1、TRAF6結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合信息合成TRAF6 3’非翻譯區(qū)（UTR）野生型載體（wt）、突變型載體（mut），并與無意義序列、miR-124-3p.1 mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，裂解各組細(xì)胞后離心取上清，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)觀察細(xì)胞熒光酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采取統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊性的多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織和細(xì)胞中miR-124-3p.1和TRAF6的表達(dá)分別與癌旁正常組織、正常培養(yǎng)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，胃癌組織和培養(yǎng)細(xì)胞中miR-124-3p.1表達(dá)下調(diào)（組織：t=6.131，P<0.001；細(xì)胞：F=134.612，P<0.001，圖1），TRAF6 mRNA和蛋白的 表 達(dá) 上 調(diào)（組 織：tmRNA=5.327，P<0.001，t蛋白=12.613，P<0.001；細(xì)胞：F=84.706，P<0.001）。其中SGC-7901細(xì)胞中miR-124-3p.1的表達(dá)變化最顯著，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以此細(xì)胞為研究對象。

圖1 胃癌組織和胃癌細(xì)胞中miR-124-3p.1和TRAF6的表達(dá)Fig.1 The expressions of miR-124-3p.1 and TRAF6 in gas?tric cancer tissues and gastric cancer cells

2.2 胃癌細(xì)胞過表達(dá)miR-124-3p.1對TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào)（t=16.706，P<0.001），N-cadherin（t=13.728，P<0.001）和Vimentin表達(dá)上調(diào)（t=15.507，P<0.001）；與TGF-β1組比較，轉(zhuǎn)染miR-124-3p.1 mimic細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)上調(diào)（t=13.352，P<0.001），N-cadherin（t=8.813，P<0.001）和Vimentin表達(dá)下調(diào)（t=9.016，P<0.001）；但TGF-β1組和TGF-β1+NC組的各蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 胃癌細(xì)胞過表達(dá)miR-124-3p.1對TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響Fig.2 The effects of miR-124-3p.1 overexpression on TGF-β1-induced EMT related proteins(n=5)

2.3 胃癌細(xì)胞過表達(dá)miR-124-3p.1對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和遷移的影響經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞侵襲率（t=34.856，P<0.001）和遷移率增高（t=9.332，P<0.001）；與TGF-β1組 比 較，轉(zhuǎn) 染miR-124-3p.1 mimic后細(xì)胞侵襲率（t=22.958，P<0.001）和遷移率降低（t=6.460，P<0.001）；但TGF-β1組和TGF-β1+NC組侵襲率和遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖3）。

圖3 胃癌細(xì)胞過表達(dá)miR-124-3p.1對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和遷移的影響Fig.3 The effects of miR-124-3p.1 overexpression on the invasion and migration of TGF-β1-induced cells(n=5)

2.4 miR-124-3p.1和TRAF6靶向關(guān)系的驗(yàn)證miR-124-3p.1與TRAF6 3′非翻譯區(qū)（UTR）42～48堿基段存在結(jié)合位點(diǎn)，推測TRAF6是miR-124-3p.1的潛在靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRAF6 3′-UTR野生型載體與miR-124-3p.1 mimic共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熒光素酶活性明顯降低（t=13.671，P<0.001），而TRAF6 3′-UTR突變型載體與miR-124-3p.1 mimic共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)上調(diào)（t=14.606，P<0.001）；與TGF-β1組比較，轉(zhuǎn)染miR-124-3p.1 mimic后TRAF6表達(dá)下調(diào)（t=9.558，P<0.001）；但TGF-β1組和TGF-β1+NC組TRAF6表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖4）。

圖4 miR-124-3p.1和TRAF6靶向關(guān)系的驗(yàn)證Fig.4 Verification of the targeted relationship between miR-124-3p.1 and TRAF6(n=5)

2.5 miR-124-3p.1靶向TRAF6對TGF-β1誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響與TGF-β1+mimic組比較，轉(zhuǎn)染攜帶有TRAF6的慢病毒載體的細(xì)胞中TRAF6（t=2.548，P=0.034）、N-cadherin（t=14.587，P<0.001）和Vimentin表達(dá)上調(diào)（t=13.864，P<0.001），E-cadherin表達(dá)下調(diào)（t=9.258，P<0.001）；但TGF-β1+mimic組和TGF-β1+mimic+vector組上述蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖5）。

圖5 miR-124-3p.1靶向TRAF6對TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響Fig.5 The effects of miR-124-3p.1 targeting T RAF6 on TGF-β1-induced EMT related proteins(n=5)

2.6 miR-124-3p.1靶向TRAF6對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和遷移的影響與TGF-β1+mimic組比較，轉(zhuǎn)染攜帶有TRAF6的慢病毒載體的細(xì)胞侵襲率（t=12.364，P<0.001）和遷移率增加（t=7.751，P<0.001）；但TGF-β1+mimic組和TGF-β1+mimic+vector組細(xì)胞侵襲率和遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖6）。

圖6 miR-124-3p.1靶向TRAF6對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和遷移的影響Fig.6 The effects of miR-124-3p.1 targeting TRAF6 on the invasion and migration of TGF-β1-induced cells

3 討 論

近年來，miRNA在腫瘤中的作用已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。WU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p可靶向整合素β3基因抑制胃癌的遷移和侵襲。LIU等[8]研究指出，miR-124-3p與胃癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，其在體外可抑制胃癌的發(fā)生，可能通過靶向調(diào)控ras相關(guān)的C3肉毒素底物1和特異性蛋白1。本研究通過熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p.1在胃癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，這與預(yù)期結(jié)果相符。識(shí)別靶基因?qū)τ诹私鈓iRNAs的生物學(xué)特性有重要作用，本研究運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，miR-124-3p.1與TRAF6存在靶向關(guān)系。

TRAF6是腫瘤壞死家族與各信號通路相偶聯(lián)的銜接蛋白，可將來自Toll樣受體、白細(xì)胞介素1受體等激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至核因子κB（NF-κB），是NF-κB信號通路的關(guān)鍵激活劑[9-10]。目前，眾多研究證實(shí)NF-κB在腫瘤中頻繁活化促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，TRAF6作為NF-κB生理反應(yīng)的主要激活蛋白，其在多種癌細(xì)胞中也發(fā)揮促癌作用[11-12]。HAN等[13]在胃癌細(xì)胞系中研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6是胃癌患者預(yù)后不良的潛在預(yù)測因子，還可調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的凋亡和侵襲能力。YANG等[14]研究表明，TRAF6可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞分化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移能力。本研究檢測TRAF6在胃癌組織和細(xì)胞中均高表達(dá)，且miR-124-3p.1可抑制胃癌細(xì)胞中TRAF6的表達(dá)，說明胃癌細(xì)胞中miR-124-3p.1和TRAF6呈負(fù)向調(diào)控。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以上皮細(xì)胞喪失極性和獲得間質(zhì)特性為主要特征，這種現(xiàn)象加強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，與腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。TGF-β1是重要的多功能調(diào)控因子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)活動(dòng)[16]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，TGF-β1介導(dǎo)的信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中有關(guān)鍵性作用[17]。E-cadherin和N-cadherin均屬于鈣黏素家族，與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，其中E-cadherin不僅可調(diào)節(jié)胚胎組織的發(fā)育、形成，傳遞細(xì)胞間信息信號，還可促進(jìn)細(xì)胞的黏附聚集、維持上皮結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞極性[18]。N-cadherin和Vimentin源自間質(zhì)細(xì)胞，可促使腫瘤細(xì)胞具有浸潤性惡性表現(xiàn)[19]。本研究中經(jīng)TGF-β1刺激胃癌細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin和Vimentin上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞后將促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力，與既往研究基本相符[20]。同時(shí)，對分別過表達(dá)miR-124-3p.1和TRAF6經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞，檢測遷移和侵襲能力、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染攜帶有TRAF6的慢病毒載體可逆轉(zhuǎn)miR-124-3p.1 mimic對胃癌細(xì)胞的抑制作用，提示過表達(dá)miR-124-3p.1靶向抑制TRAF6，下調(diào)經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，hsa-miR-124-3p.1在胃癌中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-124-3p.1可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞侵襲和遷移，其作用機(jī)制可能與靶向下調(diào)TRAF6表達(dá)有關(guān)，這為miR-124-3p.1靶向治療胃癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但miR-124-3p.1是否還有其他靶向途徑作用于胃癌還有待進(jìn)一步分析。