白云飛，王雅楠，劉昕桐，霍寧寧，時(shí)若寒，李研東，譚力銘，李沖，楊新，韓雪，3*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省獸藥監(jiān)察所，河北 石家莊 050000；3.河北省功能食品技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050000）

黑木耳（Auricularia auricula）作為一種藥食同源資源，具有豐富的營養(yǎng)和藥用價(jià)值[1]。黑木耳多糖（Auricularia auricula polysaccharides，AAP）是黑木耳中重要的活性成分[2]，作為天然活性多糖，已被證明具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能，目前研究熱點(diǎn)主要集中在黑木耳多糖的抗氧化[3]、抗腫瘤[4-6]、免疫調(diào)節(jié)[7]及益生作用[8]等方面。

針對(duì)黑木耳多糖益生作用的研究，通常以益生菌數(shù)量增殖效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而益生菌代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)人體健康具有重要作用[9]。黑木耳多糖的腸道益生作用研究通常僅針對(duì)正常生理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道菌群種類、數(shù)量等指標(biāo)進(jìn)行分析[10]，未充分考慮特殊生理人群和病理人群的特點(diǎn)。高血脂患者腸道菌群紊亂[11]，黑木耳多糖及其復(fù)配物是否具有針對(duì)該類人群的調(diào)節(jié)作用有待探究。本研究在提取并鑒定黑木耳多糖的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)其對(duì)乳酸菌蛋白質(zhì)類代謝產(chǎn)物的影響及其對(duì)高血脂人群的腸道益生作用，以期為未來高血脂人群功能性食品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

乳酸鏈球菌菌株（HW-1）：河北科技大學(xué)營養(yǎng)與功能性食品研究室保留菌種；黑木耳：中康蔬菜種植有限公司；銀耳多糖、山楂黃酮：河北科技大學(xué)營養(yǎng)與功能性食品研究室提供，乳酸菌培養(yǎng)用MRS液體或固體培養(yǎng)基[12]。辛伐他汀片：北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司（批號(hào)：31801043）。

谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、超氧化物歧化酶測試盒、丙二醛測試盒、過氧化氫酶測試盒：南京建成生物科技有限公司。

DNA提取試劑盒：美國Omega生物技術(shù)公司；MiSeq測序試劑盒：美國Illumina公司；DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；核酸純化試劑盒：美國Beckman Coulter公司；文庫定量試劑盒：美國KAPA公司。

SPF級(jí)雄性 Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證SCXK（冀）2018-004。

高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料78.8%，豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%和膽酸鹽0.2%。基礎(chǔ)飼料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供?；A(chǔ)飼料配方見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料配方Table 1 The formula of basic feed

1.2 儀器與設(shè)備

高通量測序儀（PE300）：美國Illumina公司；電泳儀（dyy-12）：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Imager HP）：美國Protein Simple公司；生物分析儀（DE13806339）：安捷倫科技有限公司；生物大分子分析儀（LabChip GX）、實(shí)時(shí)定量 PCR 儀（ABI 7500）：美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖提取與鑒定

1.3.1.1 黑木耳多糖提取

將黑木耳用液氮冷凍法粉碎后過120目篩。采用水提醇沉法，在料液比 1∶60（g/mL）、溫度 60 ℃、超聲功率180 W的條件下提取20 min，于4 500 r/min離心6 min，收集上清液。重復(fù)提取3次，合并提取液干燥備用。用苯酚-硫酸法測定溶液中多糖含量[13]。

1.3.1.2 黑木耳多糖鑒定

參考莫開菊等[14]的方法，采用苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析黑木耳多糖的單糖組成。HPLC條件：SHISEIDO C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.1 mol/L KH2PO4（pH6.8）；流動(dòng)相B為乙腈；A∶B=82∶18（體積比）；流速 1.0 mL/min；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；波長為245 nm。

1.3.2 黑木耳多糖對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物影響

將對(duì)數(shù)生長期的乳酸鏈球菌按5%的接種量，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，分別以0%、1%、5%、10%、20%、30%黑木耳多糖處理，37℃恒溫培養(yǎng)14 h。每2 h取樣并于4 200 r/min條件下離心20 min取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法[15]測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 黑木耳多糖體內(nèi)益生作用分析

將36只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白組（NC）、模型組（HFD）、辛伐他汀組（PCI）和復(fù)配物組（HDC），大鼠在自由采食高脂飼料的同時(shí)進(jìn)行黑木耳多糖復(fù)配物干預(yù)，連續(xù)給藥5周，具體處理方式見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（n=9）Table 2 Experimental design scheme（n=9）

1.3.4 檢測樣品采集

大鼠在末次灌胃12 h后，收集大鼠血清、肝臟和腦等器官，于-80℃保存?zhèn)溆?。無菌收集結(jié)腸內(nèi)糞便，置于無菌EP管中，迅速液氮冷卻后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 抗氧化能力分析

根據(jù)試劑盒說明指示，依次對(duì)腦、肝臟組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性進(jìn)行測定。

1.3.6 Illumina高通量測序

對(duì)大鼠糞便樣品進(jìn)行16S rRNA基因V3～V4區(qū)域的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)展以及Illumina高通量測序。基于腸道菌群的16S rRNA基因V3～V4區(qū)域合成相關(guān)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增所使用的引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3′）[16]。擴(kuò)增的體系和擴(kuò)增條件見表3與表4。

表3 16S rRNA基因V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增體系Table 3 16S rRNA gene V3-V4 region PCR amplification system

表4 PCR擴(kuò)增條件Table 4 PCR amplification condition

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用單因素方差分析法分析組間差異的顯著性，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳多糖提取結(jié)果

黑木耳多糖提取結(jié)果見圖1。

圖1 黑木耳多糖提取結(jié)果Fig.1 Extraction results of Auricularia auricula polysaccharides

通過掃描電鏡對(duì)黑木耳顆粒進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，如圖1（a）所示，冷凍粉碎處理的黑木耳樣品具有較高的粒度級(jí)別，并具有良好的粒度均一性。

采用苯酚硫酸法測定多糖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1（b）所示。獲得回歸方程為y=8.626 7x+0.140 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

本試驗(yàn)通過冷凍粉碎方法對(duì)黑木耳進(jìn)行前處理，多糖的提取率達(dá)10.2%。

2.2 黑木耳多糖鑒定

單糖組成色譜圖見圖2。

圖2 單糖組成色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of PMP derivatives

由圖2中各峰保留時(shí)間和峰面積，對(duì)黑木耳多糖的單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明，黑木耳多糖中主要以葡萄糖、甘露糖為主，單糖比例葡萄糖∶甘露糖∶木糖∶巖藻糖∶半乳糖∶葡萄糖醛酸為 13.47∶8.64∶2.13∶1.95∶1.69∶1.00。

2.3 黑木耳多糖益生作用研究

黑木耳多糖對(duì)乳酸鏈球菌蛋白質(zhì)代謝的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 黑木耳多糖對(duì)乳酸鏈球菌蛋白質(zhì)代謝的影響Fig.3 Effects of different concentrations of polysaccharides on protein metabolism of lactic acid bacteria

當(dāng)培養(yǎng)基中多糖含量為30%時(shí)，蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間呈拋物線式變化。在8 h時(shí)，培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值114.48 mg/L，隨后快速下降。多糖濃度0～20%時(shí)，乳酸菌的蛋白質(zhì)代謝無顯著變化。

2.4 體內(nèi)抗氧化能力分析

黑木耳多糖復(fù)配物對(duì)大鼠血清抗氧化能力的影響見表5。

表5 黑木耳多糖復(fù)配物對(duì)大鼠血清抗氧化能力的影響Table 5 Effects of A.auricula polysaccharides complex on serum antioxidant capacity in rats

黑木耳多糖復(fù)配物具有較好的抗氧化能力。由表5可知，與NC組相比，HFD組大鼠血清CAT活力與SOD 活力顯著降低（P＜0.05），GSH-Px活力降低、MDA含量升高，但不存在顯著差異（P＞0.05）。與HFD組相比，PCI組與HDC組的GSH-Px活力、SOD活力均有不同程度的升高，MDA含量降低。其中HDC組SOD活力顯著高于HFD組（P＜0.05）。

黑木耳多糖復(fù)配物對(duì)大鼠肝臟抗氧化能力的影響見表6。

表6 黑木耳多糖復(fù)配物對(duì)大鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 6 Effects of A.auricula polysaccharides complex on antioxidant capacity of rat liver

由表6可知，與NC組相比，HFD組大鼠肝臟CAT活力和 GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著升高（P＜0.05）。與HFD組相比，HDC組GSH-Px活力顯著升高。

黑木耳多糖復(fù)配物對(duì)大鼠腦抗氧化能力的影響見表7。

表7 黑木耳多糖復(fù)配物對(duì)大鼠腦抗氧化能力的影響Table 7 Effects of A.auricula polysaccharides complex on antioxidant capacity of rat brain

由表7可知，與NC組相比，HFD組大鼠腦組織GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD活力雖低于NC組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與HFD組相比，HDC組MDA含量顯著降低 P＜0.05）。

2.5 大鼠腸道菌群物種豐度及多樣性

2.5.1 分類單元聚類分析

分類單元（operational taxonomic units，OTU）交集維恩圖見圖4。

圖4 OTU交集維恩圖Fig.4 Venn diagram of OTU

試驗(yàn)以O(shè)TU相似性為97%對(duì)11個(gè)樣本進(jìn)行了OTU 分析，其中 NC 組（NC1～NC2），HFD 組（HFD1～HFD3）、PCI組（PCI1～PCI3）、HDC 組（HDC1～HDC3）。圖4可以看出，4組OTU 分別為 626、692、673、656個(gè)。共有的為527個(gè)。

2.5.2 Alpha多樣性分析

圖5為大鼠腸道菌群Alpha多樣性曲線。

圖5 大鼠腸道微生物的Alpha多樣性曲線Fig.5 Alpha diversity curve of intestinal microorganisms in rats

由圖5（a）可以看出，隨著抽樣數(shù)量的增加，測得的OTU數(shù)量先增大，后趨于平緩。說明已經(jīng)獲得環(huán)境中絕大多數(shù)細(xì)菌序列，物種不會(huì)隨著測序數(shù)量的增加產(chǎn)生明顯的變化。從圖5（b）可知，曲線逐漸趨于平緩狀態(tài)，盡管增加抽樣數(shù)量可以提高OTU數(shù)量，但是不會(huì)改變物種多樣性。從圖5（c）可以看出，隨著樣本量的增大，OTU數(shù)量從快速增加到趨于穩(wěn)定，此時(shí)腸道菌群數(shù)量不再增多，所以此時(shí)的數(shù)據(jù)量可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6和表8為各個(gè)樣品Alpha多樣性分析。

表8 腸道微生物Alpha多樣性分析Table 8 Alpha diversity of gut micrabiota

圖6 Alpha多樣性指數(shù)Fig.6 Alpha diversity index

從圖6和表8可以看出，HFD組大鼠的腸道菌群chao1指數(shù)最大，即腸道菌群豐度最高，但不存在顯著性差異；HFD組大鼠腸道菌群Shannon指數(shù)顯著高于NC、HDC組（P＜0.05）；即HFD組大鼠腸道微生態(tài)多樣性明顯高于NC、HDC組，原因可能是高脂飲食改變了腸道生態(tài)，有害菌過度繁殖，使腸道菌群多樣性增加[17]。HDC組大鼠腸道菌群的豐富度以及多樣性更接近于NC組。

2.5.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性分析可以反映不同樣本之間的菌群組成差異。圖7為4組大鼠腸道菌群的組成，圖中的點(diǎn)表示個(gè)體菌群，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離反映菌群之間的序列相似度。

圖7 基于PLS-DA的4組大鼠腸道菌群組成分析Fig.7 Composition of intestinal flora of four groups of rats based on PLS-DA

從圖7中可以看出，HFD組大鼠的腸道菌群構(gòu)成與NC組差別較大。PCI組與HDC組大鼠的腸道菌群構(gòu)成與NC組相近，其中HDC組更接近正常大鼠。說明該復(fù)配物對(duì)腸道菌群具有正向調(diào)節(jié)作用。

2.6 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 門水平差異分析

大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平的差異見圖8。

圖8 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平的差異Fig.8 Microbial community structure at the phylum level

由圖8可知，在門水平上，大鼠腸道中最多的是厚壁菌門，其次是擬桿菌門。HDC組大鼠腸道內(nèi)的放線菌門（16.41±1.81）%顯著高于 HFD 組（8.6±1.72）%（P<0.05）。HDC組擬桿菌門豐度較NC組和HFD組有下降的趨勢，但不存在顯著性差異。

2.6.2 屬水平差異分析

大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在屬水平的差異見圖9。

圖9 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在屬水平的差異Fig.9 Microbial community structure at the genus lev

由圖9可知，在屬水平上，NC組大鼠腸道中菌屬相對(duì)豐度由高到低為 Lactobacillus、Romboutsi、Rumino-coccaceae UCG-014、Ruminococcus1、Ruminococcaceae NK4A214_group等。HFD 組（10.7±4.23）%、PCI組（4.40±1.11）%的乳酸菌相對(duì)豐度較 NC組（37.71±0.63）%均極顯著降低（P<0.01）；與HFD相比，HDC組Alistipes、螺桿菌、脫硫弧菌屬含量分別降低0.10%、0.34%、0.50%，Dorea、志賀氏菌含量均降低0.11%；雙歧桿菌、乳酸菌、乳球菌含量分別增加3.06%、9.12%、0.04%。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)提取黑木耳多糖的單糖組成與莊偉等[7]的研究結(jié)果基本相符。結(jié)合已有的研究，黑木耳多糖的單糖組成與黑木耳來源相關(guān)，不同品種的黑木耳的單糖組成不同[18]。黑木耳多糖作為益生元，可有效促進(jìn)乳酸菌的增殖[19]。薛依婷等[20]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖促進(jìn)了酸乳中保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌的繁殖，并提高了酸乳中游離脂肪酸和胞外多糖的含量。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了高脂血癥大鼠中乳酸桿菌和Oscillibacter豐度下降的趨勢。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的黑木耳多糖與乳酸菌共培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳酸菌與30%黑木耳多糖共培養(yǎng)至8 h時(shí)，采用考馬斯亮藍(lán)法測定溶液中蛋白質(zhì)濃度（114.48 mg/L）與空白組相比明顯提高?？捡R斯亮藍(lán)法（Bradford法）測定溶液中的蛋白質(zhì)含量，其工作原理為染料考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸或芳香族氨基酸結(jié)合，在595 nm波長下有最大光吸收[22]。因此推測，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，黑木耳多糖提高乳酸菌蛋白酶類的代謝水平，促進(jìn)溶液中蛋白質(zhì)的降解，使得特征氨基酸充分暴露出來并與染料結(jié)合，進(jìn)而提高了其吸光度。

高脂飲食可以調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而對(duì)機(jī)體的健康產(chǎn)生影響。本研究中發(fā)現(xiàn)，高脂飲食大鼠腸道菌群與空白組相比產(chǎn)生了明顯的差異，腸道中的有害菌增加，如志賀氏菌、螺桿菌、β-變形菌綱、伯克霍爾德氏菌目、梭菌屬、糞球菌屬等；有益菌的相對(duì)豐度降低，如乳酸桿菌、雙歧桿菌等。將黑木耳多糖與銀耳多糖和山楂黃酮復(fù)配后，對(duì)高脂飲食大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察到大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其結(jié)構(gòu)向正常大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，有害菌減少，乳酸菌等有益菌的增多。這與Zhang等[21]的研究結(jié)果一致。其原因可能是黑木耳多糖影響了乳酸菌的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)，增強(qiáng)了胞外蛋白酶活性，促進(jìn)了蛋白質(zhì)水解為多肽。多肽通過乳酸菌的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)了乳酸菌的代謝水平。乳酸菌進(jìn)一步抑制腸道有害菌，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，并調(diào)節(jié)宿主代謝[23-25]。另一方面，在蛋白質(zhì)水解過程中還可以產(chǎn)生其它分子，如與乳酸菌益生作用相關(guān)的生物活性肽[26]。

綜上所述，黑木耳多糖對(duì)乳酸菌的代謝產(chǎn)物具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且黑木耳多糖復(fù)配物對(duì)高脂飲食造成的腸道菌群紊亂具有調(diào)節(jié)恢復(fù)作用，同時(shí)可以在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。