馮敏，郟自明，萬鳴，樊柏林，唐曉蕎，程文華，孫凡中*

（1.湖北省疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430075；2.湖北省中醫(yī)院藥事部，湖北 武漢 430074）

學(xué)習(xí)和記憶是大腦重要的神經(jīng)功能，《春秋緯元命苞》提到“腦之為言在也，人精在腦”，即人之精明是因?yàn)槟X具有學(xué)習(xí)記憶功能[1]。阿爾茲海默癥和腦外傷被認(rèn)為是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的主要原因，隨著人口老齡化進(jìn)程加快和環(huán)境的逐漸惡化，中樞神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率逐年升高，因其發(fā)病原因多樣且機(jī)制復(fù)雜，單純的西藥干預(yù)較難取得顯著的治療效果。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找有效成分，利用其天然營養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)相關(guān)食品成為研究熱點(diǎn)。茯苓是我國傳統(tǒng)中藥“四君八珍”之一，為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾胃、寧心安神的功效。大量研究表明[2-4]，茯苓還具有抗炎、保肝、增強(qiáng)免疫力等作用，不同部位提取物因其化學(xué)成分不同，功效也存在差異。目前，茯苓多與其它中草藥配伍，以發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，李牧函等[5]研究發(fā)現(xiàn)，以茯苓為主要成分的開心散具有改善阿爾茲海默癥小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。同時(shí)，金蘋等[6]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰絲氨酸/茯苓組合可通過保護(hù)神經(jīng)元途徑改善學(xué)習(xí)記憶能力。然而，因方劑成分復(fù)雜，功效往往不太穩(wěn)定，成分單一的單味茯苓功效可能更佳，但單味茯苓及其不同方式提取物對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用目前鮮有報(bào)道。茯苓屬于兼性寄生菌，茯苓菌生長依賴松木提供養(yǎng)分，傳統(tǒng)的種植方法需要大量砍伐松樹作為材料，不利于環(huán)境保護(hù)。為了使環(huán)境免遭破壞，研發(fā)出一種不用松木栽培茯苓的新方法，即將植物秸稈或枝條粉碎后，與松木屑、米糠、蔗糖、熟石膏等混勻，模擬松木環(huán)境和營養(yǎng)成分，制成菌袋后接種茯苓菌種，該方法能在保護(hù)松林資源的同時(shí)縮短采收期，大大增加了茯苓的生產(chǎn)效率[7]。但以此方法生產(chǎn)的代培茯苓功效是否和傳統(tǒng)方式栽培的茯苓一致，還需要進(jìn)一步研究比較。本研究通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)，探討生茯苓粉、熟茯苓粉、茯苓代培粉、茯苓水提物以及茯苓醇提物對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，旨在為使用茯苓及其不同方式提取物開發(fā)相關(guān)食品及藥品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

130只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠，18 g～22 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2020-0018，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.42000600035140。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)的獨(dú)立通氣籠具（individual ventilated cages，IVC）中，于恒溫恒濕（溫度 20℃～25℃、濕度40%～70%）環(huán)境下，12 h明暗交替飼養(yǎng)。

1.2 原料及試劑

茯苓（批號(hào)：20171028）：市售，由湖北省中醫(yī)院中藥新藥研發(fā)中心萬鳴副研究員鑒定、提取。茯苓樣品包括生茯苓粉（批號(hào)20171101-1）、熟茯苓粉（批號(hào)20171101-2）、茯苓代培粉（批號(hào) 20181010）、茯苓水提物（批號(hào)20180712，提取得率2.8%）、茯苓醇提物（批號(hào)20180715，提取得率1.7%）；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

ZH-1型自動(dòng)記錄水迷宮、ZH-600型小鼠避暗儀、YLS-3TB型跳臺(tái)記錄儀：安徽省淮北市正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

將130只小鼠隨機(jī)分為13組，每組10只，即陰性對(duì)照組，生茯苓粉低、高劑量組，熟茯苓粉低、高劑量組，茯苓代培粉低、高劑量組，茯苓水提物低、中、高劑量組，茯苓醇提物低、中、高劑量組。依據(jù)茯苓的人群推薦生藥量10 g/（人·d），按體表面積換算動(dòng)物等效劑量，小鼠等效劑量為1.3 g/（kg·d）。設(shè)置茯苓粉低、高劑量組小鼠給藥劑量分別為0.13、4.00 g/kg，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠的給藥劑量分別為0.04、0.12、0.36 g/kg，茯苓醇提物低、中、高劑量組小鼠的給藥劑量分別為0.02、0.06、0.18 g/kg。陰性對(duì)照組給予等體積的0.5%CMC。每天灌胃給藥1次，連續(xù)30 d。

1.4.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[8]的方法，于末次給藥次日開始訓(xùn)練，第一次訓(xùn)練使小鼠自動(dòng)爬梯3次，以后每次訓(xùn)練使小鼠背朝樓梯，自動(dòng)爬梯1次，根據(jù)小鼠學(xué)習(xí)成績，逐步加長路程。第一次訓(xùn)練從A點(diǎn)開始，記錄小鼠從A點(diǎn)到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間；第二次訓(xùn)練從B點(diǎn)開始，加長路程，訓(xùn)練3次至80%以上動(dòng)物在2 min內(nèi)達(dá)到終點(diǎn)后，繼續(xù)延長路程，分別記錄各小鼠每次從B點(diǎn)到達(dá)終點(diǎn)所需時(shí)間和發(fā)生錯(cuò)誤的次數(shù)（進(jìn)入任何一個(gè)盲端一次均算一次錯(cuò)誤）；末次測試從起點(diǎn)進(jìn)行，記錄從起點(diǎn)到達(dá)終點(diǎn)所需的時(shí)間和發(fā)生錯(cuò)誤的次數(shù)。為達(dá)到訓(xùn)練目的，應(yīng)引導(dǎo)2 min內(nèi)未完成訓(xùn)練的小鼠到達(dá)終點(diǎn)。每次訓(xùn)練或測驗(yàn)時(shí)各小鼠頭朝起始點(diǎn)，最后計(jì)算各組小鼠5次訓(xùn)練和測試的總錯(cuò)誤次數(shù)，到達(dá)終點(diǎn)的總時(shí)間及2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)的總小鼠數(shù)（2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)的小鼠數(shù)占該組小鼠總數(shù)的百分率），停止訓(xùn)練5 d后（包括第5天），于不同時(shí)間從起點(diǎn)進(jìn)行記憶消退實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[8]的方法，于末次給藥次日開始訓(xùn)練，將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)銅柵上，立即通以36 V的交流電使小鼠受到電擊，記錄5 min內(nèi)各小鼠跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)和第一次跳下平臺(tái)的潛伏期，以此作為學(xué)習(xí)成績。24 h后開始測驗(yàn)，記錄各小鼠第一次跳下平臺(tái)的潛伏期、3 min內(nèi)電擊次數(shù)以及受電擊的小鼠總數(shù)，同時(shí)計(jì)算出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)小鼠的百分率（受電擊的小鼠數(shù)占該組小鼠總數(shù)的百分率）。停止訓(xùn)練5 d后（包括第5天）進(jìn)行一次記憶消退實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 避暗實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[8]的方法，于末次給藥次日開始訓(xùn)練，將小鼠背向洞口放入明室，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，小鼠穿過洞口進(jìn)入暗室受到電擊，計(jì)時(shí)器自動(dòng)停止，記錄各小鼠從放入明室至遭電擊所需的時(shí)間，記為潛伏期，訓(xùn)練5 min，并記錄5 min內(nèi)電擊次數(shù)。24 h后開始測驗(yàn)，記錄每只小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期和5 min內(nèi)的電擊次數(shù)，并計(jì)算5 min內(nèi)進(jìn)入暗室（錯(cuò)誤反應(yīng)）的小鼠百分率（進(jìn)入暗室的小鼠數(shù)占該組小鼠總數(shù)的百分率）。停止訓(xùn)練5 d后（包括第5天）進(jìn)行一次記憶消退實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

水迷宮實(shí)驗(yàn)中，茯苓對(duì)小鼠記憶獲得的影響見表1、表 2。

表1 茯苓對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠記憶獲得影響Table 1 Effect of Poria cocos on memory acquisition of mice in water maze experiment

續(xù)表1 茯苓對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠記憶獲得影響Continue table 1 Effect of Poria cocos on memory acquisition of mice in water maze experiment

表2 茯苓對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠記憶消退的影響Table 2 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in water maze experiment

由表1和表2可知，記憶獲得期和記憶消退期各組小鼠到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間與陰性對(duì)照組比較均無顯著差異；部分茯苓組小鼠記憶獲得期到達(dá)終點(diǎn)前錯(cuò)誤次數(shù)與陰性對(duì)照組比較顯著增加（P<0.05），而記憶消退期均無顯著差異；部分茯苓組小鼠記憶獲得期2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)的小鼠數(shù)與陰性對(duì)照組比較顯著增加（P<0.05），以上結(jié)果說明茯苓對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用，但若需更顯著的效果出現(xiàn)，可能還需更長時(shí)間的干預(yù)。

2.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，茯苓對(duì)小鼠記憶的影響結(jié)果見表3～表5。

表3 茯苓對(duì)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期小鼠記憶的影響Table 3 Effect of Poria cocos on memory of training mice in diving platform experiment

表4 茯苓對(duì)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測驗(yàn)期小鼠記憶的影響Table 4 Effect of Poria cocos on memory of mice in the test period of the diving platform experiment

表5 茯苓對(duì)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)小鼠記憶消退的影響Table 5 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in diving platform experiment

由表3～表5可知，茯苓組各組小鼠訓(xùn)練期的潛伏期與陰性對(duì)照組比較均縮短，錯(cuò)誤次數(shù)與錯(cuò)誤反應(yīng)率無顯著差異；部分茯苓組小鼠測驗(yàn)期和記憶消退期錯(cuò)誤反應(yīng)率顯著降低（P＜0.01），潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)無明顯改善。以上結(jié)果說明茯苓對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用，但與其提取方式和劑量相關(guān)。其中生茯苓粉高劑量組、熟茯苓粉高劑量組可顯著降低測驗(yàn)期錯(cuò)誤反應(yīng)率，效果較佳；生茯苓粉高劑量組、熟茯苓粉各劑量組、茯苓代培粉高劑量組、茯苓水提物中劑量組可顯著降低記憶消退錯(cuò)誤反應(yīng)率，生茯苓粉高劑量組和茯苓代培粉高劑量組小鼠記憶消退潛伏期顯著延長。但這些茯苓組對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的改善要出現(xiàn)顯著差異，需進(jìn)行更長時(shí)間的干預(yù)。

2.3 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

避暗實(shí)驗(yàn)中，茯苓對(duì)小鼠記憶的影響結(jié)果見表6～表8。

表6 茯苓對(duì)避暗實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期小鼠記憶的影響Table 6 Effect of Poria cocos on memory of training mice in avoid dark experiment

表7 茯苓對(duì)避暗實(shí)驗(yàn)測驗(yàn)期小鼠記憶的影響Table 7 Effect of Poria cocos on memory of mice in the test period of the avoid dark experiment

表8 茯苓對(duì)避暗實(shí)驗(yàn)小鼠記憶消退的影響Table 8 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in avoid dark experiment

由表6～表8可知，茯苓代培粉低劑量組、茯苓醇提物低劑量組的測驗(yàn)期錯(cuò)誤反應(yīng)率與陰性對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05），但記憶消退期各茯苓組錯(cuò)誤反應(yīng)率均顯著升高（P＜0.05），說明茯苓可在一定時(shí)間和劑量范圍內(nèi)發(fā)揮顯著作用，隨著干預(yù)時(shí)間的延長會(huì)逐漸失去功效，可能與其毒理作用的表現(xiàn)有關(guān)。

3 討論

根據(jù)茯苓的藥理特性，分析其改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)制可能有以下兩個(gè)方面：一方面可以調(diào)控中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)。有研究表明[9-10]，茯苓可有效降低大腦乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AchE）活性，提高小鼠腦指數(shù)，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）參與協(xié)調(diào)大腦皮層情緒和運(yùn)動(dòng)等功能，是中樞神經(jīng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，影響著機(jī)體的學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力，AchE通過水解ACh控制膽堿神經(jīng)元突觸間的信息傳遞，進(jìn)而調(diào)控腦功能[11]。另一方面抑制過氧應(yīng)激反應(yīng)。Benzi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，過氧化應(yīng)激增強(qiáng)是導(dǎo)致老年癡呆癥的重要原因。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）控制著機(jī)體氧化與抗氧化平衡，丙二醛（malondialdehyde，MDA）活性的高低可以反映機(jī)體內(nèi)氧自由基水平和細(xì)胞損傷程度，茯苓可通過提高SOD活性降低MDA活性，加速清除體內(nèi)自由基，從而減少過氧應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，改善學(xué)習(xí)記憶能力[13]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，生茯苓粉、熟茯苓粉、茯苓代培粉、茯苓水提物以及茯苓醇提物均具有改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用，其中茯苓代培粉既可增強(qiáng)水迷宮實(shí)驗(yàn)中小鼠記憶獲得能力，又可降低跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中小鼠錯(cuò)誤反應(yīng)率、延長記憶消退潛伏期，還能降低避暗實(shí)驗(yàn)中小鼠錯(cuò)誤反應(yīng)率，其對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能改善作用最佳。綜上所述，茯苓具有改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)和抑制過氧應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，以茯苓為主要成分開發(fā)食品或藥品，將在預(yù)防中樞神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域具有較大的社會(huì)價(jià)值。