陳健敏，劉欣瑩，劉思彎，何澤敏，余思錦

(1.莆田學院 藥學與醫(yī)學技術學院，福建 莆田 351100；2.藥物分析與檢驗醫(yī)學福建省高校重點實驗室, 福建 莆田 351100)

經皮給藥系統(tǒng)(transdermal drug delivery system,簡稱TDDS)因其攜帶及使用較為方便，能避免肝臟首過效應、維持穩(wěn)定的血藥濃度而減少副作用、提高患者依從性等優(yōu)點，具有巨大的市場前景.微針(microneedles, 簡稱MNs)作為一種新型的TDDS技術，具有高效、無痛和安全的特點，能有效打破角質層對藥物的屏障作用，提高藥物遞送效率，廣泛用于小分子親水性藥物和生物大分子的遞送.近年來，采用水溶性高分子材料為基質制備的可溶性微針(dissolving microneedles,簡稱DMNs)，受到了科學界的廣泛關注.DMNs作用于皮膚后，可溶性針體吸收皮膚中的組織液，便發(fā)生溶解，包埋的藥物隨即釋放，在局部產生作用或經皮膚內的毛細血管進入體循環(huán)而產生全身效應.然而，由于水溶性材料的溶解速度較快，藥物吸收過程的時間與注射給藥吸收過程相近，這樣不利于緩釋藥物的遞送.因此，筆者通過在可溶性微針針體上包覆一層涂層，以達到藥物緩釋的目的，此項研究在國內外未見報道.該研究先采用溶液澆鑄法制備針體載藥的可溶性微針(tip-loaded dissolving microneedles, 簡稱TDMNs)，然后通過筆者課題組自行組裝的旋涂機，將緩釋涂層均勻地涂布在微針針體上，形成包覆涂層的針體載藥的可溶性微針(coated TDMNs，簡稱CTDMNs)，詳細考察高分子涂層材料和濃度、旋涂的轉速等各種參數(shù)對藥物釋放的影響規(guī)律，同時對其力學性能和安全性進行評估.

1 材 料

1.1 儀 器

700D單反相機，佳能；BSM電子天平，上海卓精科技有限公司；YB-P6智能透皮儀，北京新諾華儀器有限公司；JJ-1AS數(shù)顯增力電動攪拌器，常州朗越儀器制造有限公司；Handpi-NK-50測力儀，深圳市艾爾瑪機電；HLA數(shù)顯螺旋測試機架，艾得堡儀器；Finland經皮水分流失儀，Delfin Technology；UV2550紫外可見光分光光度計，日本島津；Spectrofluorometer FS5熒光分光光度計，英國愛丁堡.

1.2 藥品與試劑

聚苯乙烯(PS，批號：D8945)、聚乳酸(PLA，批號：P169115)、明膠(GL，批號：C1603064)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K29-32，批號：J1431062)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯(批號：J1530023，純度：AR)、核黃素(批號：C1603016,純度：98%)、熒光素鈉(批號：F1426015，純度：AR)、羅丹明B(批號：W5696，純度：AR)，山東西亞化學股份有限公司；美洛昔康(批號：N0906A，純度：AR)，大連美侖生物技術有限公司.

1.3 皮膚模型與實驗動物

雄性SD大鼠((200±10)g)購于福建省閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限公司.大鼠飼養(yǎng)在(22±1)℃，相對濕度為40%～60%，12 h明暗循環(huán)的動物房中，自由采食，至少適應1周.動物相關的試驗步驟與方法均嚴格按照莆田學院動物倫理委員會的批件執(zhí)行.大鼠用5%水合氯醛溶液(劑量為0.7 mL/100 g)麻醉后處死，進行脫毛處理，取腹部皮膚，用PBS溶液洗凈，分裝于自封袋中，放入冰箱冷凍室(—20 ℃)儲藏備用.實驗前，取出鼠皮，在PBS溶液中浸泡1 h后再使用.進行經皮水分流失試驗時，提前一天將SD大鼠腹部進行脫毛處理，在整個試驗過程中大鼠作麻醉處理.

2 實驗方法

2.1 包覆涂層的針體載藥的可溶性微針(CTDMNs)的制備

針體載藥的可溶性微針的制備方法采用筆者課題組之前報道的方法，并做微小的調整.首先，將含有藥物的PVP針體溶液(10%)，注入PDMS微針模具中，使溶液均勻覆蓋模具表面，然后加壓使溶液進入模具微孔，待其干燥后在模具中加入熔融的PCL，待其凝固后脫模，獲得TDMNs.用鑷子夾住TDMNs的背襯邊緣，將其用膠水固定在自制的旋涂機上，浸入高分子溶液(例如乙酸乙酯為溶劑的1% PLA、GL和PS高分子溶液)后立即提起，啟動旋涂機，帶動TDMNs快速旋轉，將多余的高分子溶液甩出，在TDMNs針體表面形成一層薄的高分子涂層，室溫干燥后即得到CTDMNs.該制備過程如圖1所示.

圖1 包覆涂層的針體載藥的可溶性微針(CTDMNs)的制作流程

2.2 各參數(shù)對CTDMNs中藥物釋放行為的影響

能夠有效影響藥物釋放行為的參數(shù)主要包括：高分子涂層材料的種類和濃度，旋涂機的轉速，包覆涂層的次數(shù)等.在以下試驗中，若無特殊說明，均以羅丹明B為模型藥物制備TDMNs，再進行涂層包覆試驗.試驗采用單因素變量的方法，考察不同參數(shù)對藥物釋放行為的影響.首先考察不同高分子涂層材料對藥物釋放的影響，將PLA，GL，PS分別溶于乙酸乙酯中配制成1%的高分子涂層溶液，設置轉速為600 r·min，包覆涂層次數(shù)為1次.根據(jù)結果發(fā)現(xiàn)PS涂層的緩釋能力較強，因此固定轉速為600 r·min，包覆涂層次數(shù)為1次，配制不同濃度(1%，3%，5%，10%)的PS溶液，考察高分子涂層溶液濃度對藥物釋放行為的影響.確定最佳濃度的PS后，再固定包覆涂層次數(shù)為1次，考察轉速對藥物釋放行為的影響.最后固定最佳濃度的PS，轉速為600 r·min，考察包覆涂層次數(shù)對藥物釋放行為的影響.

采用智能透皮儀探究藥物的釋放速率，具體步驟如下：用膠水將CTDMNs的背襯固定在一個圓形塑料片上，然后針尖朝下扣在Franz透皮杯的接收池上，再將給藥池扣在塑料片上，夾上馬蹄鐵，然后往接收池中加入PBS溶液.將Franz透皮杯置于水浴中(37 ℃)，磁子以 280 r·min的速度攪拌，開始試驗.在試驗的0.5，1，2，4，6，8，10，20，40，60 min，從接收池中取出全部接收液，并立即加入等量的PBS.每組3個平行(

n

=3)，采用紫外分光光度法檢測接收液中的羅丹明B(測定波長為556 nm)的含量，所獲得的標準曲線方程為

Y

=0.119 3

X

-0.001 0(

R

= 0.999 6)，濃度范圍為0.01～10 μg·mL.計算每個時間點的藥物累積釋放量，再將其對時間作圖.

2.3 不同藥物對釋放行為的影響

藥物的釋放行為與藥物本身的性質有關，筆者所提到的包覆涂層的方法是否適用于其他藥物的緩釋，尚不可知.因此，除了之前探索旋涂條件時采用的藥物羅丹明B之外，又隨機挑選了3種藥物進行研究，包括核黃素、美洛昔康和熒光素鈉.首先配制3種藥物的溶液(1%)，然后按照2.1的方法制備CTDMNs，各參數(shù)設置如下：1%PS、轉速600 r·min、包覆涂層次數(shù)為1次.仍采用智能透皮儀考察藥物的釋放速率，如2.2所述.采用紫外分光光度法測定接收液中的美洛昔康(測定波長為362 nm)的含量，標準曲線方程為

Y

= 0.054 3

X

+0.001 9(

R

=0.997 8)，濃度范圍為0.01～10 μg·mL.采用熒光分光光度法測定接收液中核黃素(激發(fā)波長為440 nm、發(fā)射波長525 nm)的含量，標準曲線方程為

Y

= 66.743

X

+5.583 3(

R

=0.994 6)，濃度范圍為0.01～4 μg·mL.采用熒光分光光度法測定接收液中熒光素鈉(激發(fā)波長為491 nm、發(fā)射波長512 nm)的含量，標準曲線方程為

Y

= 145.8

X

-3.872 8(

R

=0.999 9)，濃度范圍為0.01～8 μg·mL.計算每個時間點的藥物累積釋放量，再將其對時間作圖.

2.4 力學性能考察及皮膚穿刺試驗

用Handpi-NK-50測力儀和數(shù)顯螺旋測試機架搭建的微針力學強度測試儀，測試CTDMNs的力學性能.簡單來說，先把微針置于底座上，針尖朝上，再將測試儀的平頭鋁制圓柱探頭(直徑10 mm)以0.5 mm·min的恒定速度垂直向下移動至CTDMNs的尖端，并記錄位移和力值，直至達到預設的最大位移(0.5 mm).在試驗過程中，當力達到0，10，20，30，40，50 N時，暫時取下CTDMNs進行觀察并拍照.為了考察CTDMNs對皮膚的穿刺能力和效率(penetration efficiency，簡稱PE)，用大拇指將包埋羅丹明B的CTDMNs壓入離體大鼠皮膚；按壓10 min后，取下的CTDMNs和被處理后的皮膚用顯微鏡和單反相機(配微距鏡頭)觀察并拍照.PE(%)的計算公式如下：PE(%)=(染色孔數(shù)/微針數(shù))×100.

2.5 經皮水分流失測試與皮膚恢復情況

動物試驗開始前采用水合氯醛進行麻醉處理，再將SD雄性大鼠腹部進行脫毛處理，然后用大拇指將CTDMNs作用于腹部皮膚，10 min后移除.采用經皮水分流失測試儀記錄每個固定時間點(10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h)的經皮水分流失(transepidermal water loss，簡稱TEWL)情況.靠近微針作用位點的臨近部位皮膚作為空白對照.實驗重復3次(

n

=3)，TEWL值以g·m·h表示.在處理前、處理后(0 min,10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h)，用單反相機記錄大鼠腹部皮膚的恢復情況.

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每個試驗至少做3次平行(

n

=3)，數(shù)值用平均值±標準偏差(SD)表示.采用微軟Excel軟件(2007版)對數(shù)據(jù)進行分析處理.采用單因素方差分析(ANOVA)和學生

t

檢驗進行統(tǒng)計學分析.

p

值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學意義.

3 結果與討論

3.1 CTDMNs的基本形態(tài)特征

以羅丹明B作為模型藥物，將其包埋在可溶性微針的針體內，制備的TDMNs(圖2(a))完整地復制出了微針的結構，12 × 12 的微針陣列，每根微針長度為680 μm, 基底的邊長為380 μm，針尖距離為600 μm，整個微針陣列的面積約0.75 cm，而且藥物基本都集中于針體部位.在包覆一層PS涂層后，微針的整體形貌未發(fā)生較大的變化，似乎蒙上一層透明薄膜，如圖2(b)所示.為了更好地觀察包覆的PS涂層，制備了不含藥物的空白微針，如圖2(c)所示.然后在PS溶液中加入蘇丹紅，仍采用上述方法涂布，結果發(fā)現(xiàn)一層含蘇丹紅的PS涂層均勻地涂布在微針表面(圖2(d))，表明上述方法確實成功地在微針表面形成一層涂層.

(a)TDMNs；(b)包覆PS涂層的TDMNs；(c)不含藥物的空白微針；(d)包覆含蘇丹紅的PS涂層的TDMNs.

3.2 各參數(shù)對藥物釋放行為的影響

如何選擇合適的高分子涂層材料十分重要，這直接關系到CTDMNs的緩釋效果.而涂層材料需要溶解形成溶液才能方便涂布，而使用的溶劑又不能快速溶解TDMNs的針體材料(PVP).因此，高分子涂層材料溶劑的選擇受到較大的限制，通過預實驗研究，最終確認乙酸乙酯作為高分子涂層材料的溶劑.以乙酸乙酯作為溶劑，通過溶解度的預試驗初步選擇了PLA，GL，PS作為進一步優(yōu)選的高分子涂層材料，并對材料種類對藥物釋放行為的影響進行了研究，結果如圖3(a)所示.PLA涂層中藥物釋放速率與未包覆涂層的對照組(Control)相比，并沒有顯著性差異(

p

>0.05)，說明PLA涂層緩釋能力較差.GL和PS組各個時間點的釋放率均顯著低于對照組(

p

<0.05)，表明這兩種材料在TDMNs上形成的涂層均能實現(xiàn)藥物的緩釋.更具體地來看，對照組在5 min左右的釋放率已基本達到100%，而PS組在60 min時才釋放95.8%.因此后續(xù)試驗均采用安全無毒的PS作為高分子涂層材料，而且其良好的物理機械性能也有助于增強微針的機械強度.為了探索PS濃度對藥物釋放的影響，采用上述方法將1%，3%，5%，10%的PS溶液分別涂布在TDMNs上，結果如圖3(b)所示.隨著PS濃度的增加，藥物的緩釋效果也逐漸增強，每組在每個時間點的釋放率均顯著低于對照組(

p

<0.05).然而增強幅度卻隨著PS濃度的增加有所下降，3%組和5%組之間的釋放率并沒有顯著性差異(

p

>0.05).雖然10%組的釋放率顯著低于3%組的，但是當PS濃度達到10%時，溶液已經相對黏稠，不利于溶液的均勻涂布.因此綜合考慮，后續(xù)的試驗均采用濃度為3%的PS溶液.

不同轉速(400，600，800 r·min)對藥物釋放行為的影響如圖3(c)所示，隨著轉速的提高，藥物的釋放率顯著下降，因此可以通過控制轉速來控制CTDMNs的藥物釋放速度.值得注意的是，在試驗過程中，發(fā)現(xiàn)轉速低于400 r·min，不容易將微針上的高分子溶液甩出，導致涂布不均勻，因此涂布過程轉速應高于該轉速.在600 r·min的轉速下，又考察了包覆涂層次數(shù)對藥物釋放的影響，結果如圖3(d)所示.結果發(fā)現(xiàn)，隨著包覆涂層次數(shù)的增加，藥物釋放速率也有規(guī)律地緩慢下降，雖然下降程度較小，但是仍然可以通過包覆涂層次數(shù)控制藥物的釋放速度.因此，可以通過調節(jié)高分子涂層材料的種類與濃度、旋涂機的轉速和包覆涂層次數(shù)來實現(xiàn)藥物的緩控釋.

圖3 各參數(shù)對藥物釋放行為的影響

3.3 不同藥物在CTDMNs內的釋放

4種藥物(熒光素鈉(Sodium fluorescein)、羅丹明B(Rhodamine B)、核黃素(Riboflavin)和美洛昔康(Meloxicam))均分別被包埋在TDMNs中，采用上述包覆涂層的方法，成功制備了4種不同的CTDMNs，如圖4(a)所示.4種藥物均被包埋于TDMNs針體內，而且包覆涂層后的CTDMNs均保持微針形態(tài)的完整.包埋熒光素鈉的CTDMNs的緩釋效果如圖4(b)所示，空白對照(Control)在10 min時的釋放率已經達到98.5%，而包覆1%PS涂層后，直到60 min才釋放98.5%，表明涂層起到了緩釋作用.包埋羅丹明B(圖4(c))的CTDMNs的緩釋效果已在前面提及，在此不再贅述.同樣地，與相應的空白對照相比，包埋核黃素(圖4(d))和美洛昔康(圖4(e))的CTDMNs釋放速率均顯著下降(

p

<0.05).從PubChem中查詢4種藥物的溶解度數(shù)據(jù)如下：100 mL水中可溶解熒光素鈉10 g(20 ℃)、羅丹明B 5 g(20 ℃)、核黃素8.47 mg(25 ℃)、美洛昔康0.715 mg(25 ℃)，由此可見，熒光素鈉屬于易溶于水的藥物，羅丹明B屬于可溶于水的藥物，核黃素和美洛昔康均屬于難溶于水的藥物.把4種藥物的釋放速率匯總比較(圖4(f))，可以看出藥物的溶解度越低，釋放速度越慢，也表明該包覆涂層的方法可使易溶性和難溶性藥物均實現(xiàn)緩釋作用.

(a)包埋4種不同藥物的CTDMNs；(b)～(e)分別為包覆1%PS涂層前、后的可溶性微針熒光素鈉、羅丹明B、核黃素、美洛昔康的釋放速率；(f)包埋4種不同藥物的CTDMNs的釋放比較.

3.4 力學性能考察及皮膚穿刺試驗

通過自制的微針力學強度測試儀，測試CTDMNs的力學強度，結果如圖5(a)所示.從圖中可以看出，在微針陣列受到小于30 N壓力的作用時，微針針尖形貌基本沒有變化.當壓力大于30 N，微針針尖才稍微變鈍，直到壓力為50 N時，針尖形貌變化才更加明顯.雖然針尖變鈍了，但是沒有發(fā)現(xiàn)有針尖發(fā)生明顯斷裂的情況，表明CTDMNs具有較強的韌性.一片CTDMNs上共有144根微針，壓力為30 N時，每根微針的壓力為0.21 N.根據(jù)文獻[17]報道，微針針尖壓力達到0.03 N·tip就能夠刺入皮膚，筆者試驗的微針能夠承受的壓力是其7倍，因此可以預見CTDMNs具有足夠的力學強度刺入皮膚.這也被接下來的穿刺試驗所證實，結果如圖5(b)所示，CTDMNs作用于皮膚10 min后，針體前端部分已基本溶解.作用后的皮膚上形成了染色的微孔，清晰明顯的染色孔數(shù)達到了約140個，穿刺效率達97.2%.雖然CTDMNs具有足夠的機械強度，但穿刺效率未達到100%，原因可能是由于皮膚具有的彈性和毛發(fā)產生的阻力所致.試驗結果表明CTDMNs具有足夠的機械強度刺入皮膚，而且藥物能夠有效地釋放進入皮膚.

圖5 力學性能考察及皮膚穿刺試驗

3.5 經皮水分流失與皮膚恢復情況

TEWL是最重要的皮膚屏障特征之一，其異常與皮膚屏障損害有關.因此，通過測量TEWL值，可以評估CTDMNs對皮膚的損傷和隨后的皮膚恢復情況，結果如圖6(a)所示.CTDMNs作用皮膚后，TEWL值即刻增加至(54.03±3.85)g·m·h，遠高于空白對照組((13.50±1.65)g·m·h)，表明CTDMNs能有效地刺穿皮膚，從而打破皮膚的屏障效應.實際上，CTDMNs作用后會立即在皮膚上產生數(shù)百個微孔，如圖6(b)所示.隨著時間的增加，TEWL值在最初的2 h內急劇下降，這表明皮膚正在迅速恢復其屏障功能.更具體地看，6 h后CTDMNs的TEWL值下降到(13.80±1.37)g·m·h，與對照組((12.2±1.69)g·m·h)無顯著性差異(

p

>0.05)，表明皮膚已完全恢復其屏障作用.皮膚屏障功能的迅速恢復降低了潛在的感染風險，說明CTDMNs具有較高的安全性，可以頻繁使用.

圖6 CTDMNs作用皮膚

4 結束語

筆者建立了一種在可溶性微針上包覆一層緩釋涂層的方法，成功制備了CTDMNs，并對影響藥物釋放的各個參數(shù)，包括高分子涂層材料的種類和濃度、旋涂機的轉速、包覆涂層的次數(shù)等，進行了研究并實現(xiàn)了藥物的緩控釋.采用這種方法對包埋核黃素、羅丹明B、美洛昔康和熒光素鈉4種藥物的微針進行涂層的包覆，均實現(xiàn)了緩釋效果，證明了該方法的普適性.根據(jù)力學強度測試和皮膚穿刺試驗的結果，表明所制備的CTDMNs具備足夠的力學強度，足以刺入皮膚而不斷裂.經皮水分流失試驗和皮膚恢復情況表明CTDMNs作用后6 h，皮膚基本恢復屏障作用，表明由微針引起的微孔已基本愈合，證明該微針的使用相對安全.綜上所述，筆者所制備的CTDMNs具有一定的緩控釋能力，具備成為藥物載體的潛力.