陳林勇 李國富 劉建民 任恒星 何 環(huán)苗 彪 趙 娜 宋燕莉

(1.河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，454000 河南焦作；2.煤與煤層氣共采國家重點(diǎn)實驗室，048000 山西晉城；3.中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，煤炭加工與清潔利用教育部 重點(diǎn)實驗室，221116 江蘇徐州)

0 引 言

根據(jù)成因類型，煤層氣可分為生物成因氣和熱成因氣[1-2]。其中，生物成因氣又可分為成煤物質(zhì)在早期形成的原生生物氣和成煤后煤層被抬升到淺部在微生物的作用下形成的次生生物氣[3-4]。通常認(rèn)為原生生物氣是由早期泥炭沼澤環(huán)境中的泥炭或低級煤通過細(xì)菌分解等一系列復(fù)雜過程生成[5]，其生成機(jī)理可用ZINDER et al于1993年提出的四階段發(fā)酵理論進(jìn)行概括性的描述[6]。次生生物氣的生成機(jī)理研究經(jīng)歷了由淺到深的過程，早期認(rèn)為是由煤化過程中產(chǎn)生的濕氣和正烷烴等經(jīng)細(xì)菌作用而形成[3]，目前可較為詳細(xì)地闡明其代謝途徑[7-9]。

影響煤生物產(chǎn)氣效率的諸多因素可以歸納為兩類，一類影響底物的可利用性，如煤階、煤樣粒度、煤的顯微組分和孔裂隙等[10-14]；另一類影響菌群的活性，如溫度、pH、Eh和營養(yǎng)成分等[13，15]。因此，為提高產(chǎn)氣效率，通?？蓮纳鲜鰞煞矫鎯?yōu)化實驗條件來提高煤的生物可利用性[16-19]或增強(qiáng)菌群的活性[20]。此外，還可以通過解除產(chǎn)氣的抑制因素來提高產(chǎn)氣效率。在厭氧消化領(lǐng)域，胺抑制、酸抑制和重金屬抑制等已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注和研究[21-26]，然而針對煤制生物氣抑制因素的研究還較少。有學(xué)者研究證實了煤的添加量對產(chǎn)甲烷抑制現(xiàn)象的存在，例如，YOON et al[27]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中超過6 g/L的褐煤劑量對生物生成甲烷有抑制作用；王保玉等[11]研究發(fā)現(xiàn)煤粉的存在抑制了微生物對營養(yǎng)液的利用。部分學(xué)者研究了可能對產(chǎn)甲烷有抑制作用的因素，例如，張倩等[14]認(rèn)為石英砂、菱鐵礦、水化硅酸鈣和氧化亞鐵鎂等礦物對煤的生物產(chǎn)氣存在抑制作用；董利超等[28]認(rèn)為腐植酸前體物質(zhì)木質(zhì)素抑制褐煤生物甲烷化，這些研究多側(cè)重于通過外源物質(zhì)的添加證實抑制作用的存在。為提高煤制生物甲烷的產(chǎn)氣效率，有必要研究對產(chǎn)甲烷有抑制作用的因素，為后續(xù)研究解除產(chǎn)氣抑制因素提供參考。因此，筆者通過分析發(fā)酵液成分在產(chǎn)氣過程中的變化及煤的甲醇萃取物的產(chǎn)氣特征研究了過量煤粉對產(chǎn)甲烷的抑制現(xiàn)象及成因。

1 實驗部分

1.1 煤樣與菌源

實驗所用煤樣采自河南義馬，將新鮮煤樣粉碎至0.15 mm～0.20 mm后于70 ℃干燥備用，煤樣的工業(yè)分析結(jié)果見表1。實驗所用菌源為藍(lán)焰煤層氣公司SH121井排采水。將10 kg河南義馬塊煤加入200 L自制的發(fā)酵罐中，再將采集到的40 L新鮮排采水樣品加入發(fā)酵罐中，然后加入40 L 0.1%YE培養(yǎng)基(酵母粉YE 1 g，K2HPO42.9 g，KH2PO41.5 g，NH4Cl 1.8 g，MgCl20.4 g，超純水1 L)，通入高純氮?dú)?99.99%)曝氣30 min以驅(qū)除培養(yǎng)液中的氧氣，于30 ℃恒溫培養(yǎng)，通過罐體上的壓力表觀察產(chǎn)氣量，利用氣相色譜儀(Angilent 7890，美國)檢測甲烷體積分?jǐn)?shù)的變化。待甲烷產(chǎn)量趨于平緩后，放出40 L發(fā)酵液，然后補(bǔ)加40 L新鮮的滅菌的0.1%YE培養(yǎng)基，重復(fù)以上操作5次，保證富集馴化得到能夠利用煤產(chǎn)氣的穩(wěn)定菌源。

表1 煤樣的工業(yè)分析Table 1 Proximate analysis of coal samples

1.2 實驗方法

1.2.1 煤生物模擬產(chǎn)氣實驗

在500 mL厭氧瓶中加入300 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(K2HPO42.9 g，KH2PO41.5 g，NH4Cl 1.8 g，MgCl20.4 g，超純水1 L)和30 g煤樣，以不加煤樣為對照組，通入高純氮?dú)怛?qū)氧，鋁封后濕熱滅菌，每組做3個平行實驗。滅菌冷卻至室溫后，利用無菌注射器接種10 mL前期富集培養(yǎng)的穩(wěn)定菌液，接種液清澈、無沉淀或懸浮物(見圖1a)。于30 ℃恒溫培養(yǎng)，實驗周期為120 d，定期通過壓力表記錄壓力變化，利用氣相色譜儀分析氣體成分，根據(jù)壓力及氣體成分計算產(chǎn)甲烷的量。

轉(zhuǎn)接實驗：選取上述實驗組中產(chǎn)甲烷量最高的平行樣作為菌源，在100 mL厭氧瓶中加入40 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基和4 g煤樣，接種1 mL菌液。為保證菌源的均勻性，接種前將菌液搖勻，使沉淀的煤粉與發(fā)酵液充分混合，發(fā)酵液呈黑色(見圖1b)。其他操作同1.2.1節(jié)。

圖1 實驗所用接種液Fig.1 Inoculum used in experimentsa—Inoculum without pulverized coal；b—Inoculum with pulverized coal

煤粉量梯度實驗：以前期富集培養(yǎng)的穩(wěn)定菌液為菌源，在100 mL厭氧瓶中分別加入0.01 g，0.05 g，0.25 g，1.25 g和6.25 g煤樣，接種10 mL菌液，加入40 mL 0.1%YE培養(yǎng)基。其他操作同1.2.1節(jié)。定期取發(fā)酵液，利用Agilent HPLC-QTOF(1290-6530)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定液體成分。色譜柱為ZORBAX SB-C8，柱溫為25 ℃。流動相A為100%甲醇，流動相B為含0.1%甲酸的超純水，流動相梯度見表2。離子源設(shè)置為干燥氣溫度300 ℃，流速11 L/min，霧化器壓力5 344.738 kPa，毛細(xì)管電壓3 500 V，碎裂電壓130 V，狹縫電壓55 V。

表2 液相色譜流動相梯度Table 2 Mobile phase gradient of liquid chromatography

1.2.2 義馬煤甲醇萃取物的生物產(chǎn)氣實驗

在索氏提取器中加入200 mL甲醇和50 g煤粉，于60 ℃萃取100 h。萃取完成后，在45 ℃下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮，用甲醇定容至100 mL，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定液體成分。

分別在兩個250 mL厭氧瓶中加入2 mL甲醇萃取物(實驗組)和2 mL甲醇(對照組)，并設(shè)置3個平行，通氮?dú)獗Ｗo(hù)。每個厭氧瓶中加入120 mL 0.1%YE培養(yǎng)基，鋁封后濕熱滅菌。利用注射器為每個瓶中接種5 mL富集培養(yǎng)的穩(wěn)定菌液，培養(yǎng)方式同1.2.1節(jié)。

2 結(jié)果與討論

2.1 煤生物產(chǎn)氣特征

模擬實驗、轉(zhuǎn)接實驗和煤粉量梯度實驗的累計產(chǎn)甲烷量見圖2。由圖2a可以看出，模擬實驗中實驗組和對照組累計產(chǎn)甲烷量分別為0.42 mmol和0.16 mmol，由于沒有額外添加有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，證明了微生物可以利用煤產(chǎn)甲烷。對照組(沒有添加煤)仍有甲烷產(chǎn)生，說明接種會帶入一定量的物質(zhì)作為產(chǎn)氣底物，由于接種液清澈、無沉淀或懸浮物，又說明由接種帶入的底物是溶解性物質(zhì)，結(jié)合1.1節(jié)所述可知，菌源富集馴化的過程就是煤生物發(fā)酵的過程，接種液即發(fā)酵液中含有微生物降解煤產(chǎn)氣的中間產(chǎn)物[29-30]。由表1可知，實驗前后煤的灰分和揮發(fā)分含量降低，其中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由29.20%降低至19.70%，揮發(fā)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由43.87%降低至38.09%，說明灰分和揮發(fā)分參與了煤生物氣的轉(zhuǎn)化，這與張倩等[14]的研究結(jié)論一致。

圖2 模擬實驗和轉(zhuǎn)接實驗及煤粉量梯度實驗的累計產(chǎn)甲烷量Fig.2 Cumulative methane production of simulation experiment and transfer experiment and gradient experiment of coal consumptiona—Simulation experiment；b—Transfer experiment；c—Gradient experiment of coal consumption

由圖2b可知，轉(zhuǎn)接實驗中實驗組和對照組累計產(chǎn)甲烷量分別為0.15 mmol和0.19 mmol，實驗組產(chǎn)氣量低于對照組產(chǎn)氣量，與正常情況時相反。這是由于轉(zhuǎn)接實驗接種時帶入了少量煤粉，結(jié)合最終的累計產(chǎn)甲烷量推測，接種液帶入的煤粉作為底物參與了甲烷的產(chǎn)生，實驗組中加入的煤不但沒有作為產(chǎn)氣底物參與甲烷的產(chǎn)生反而由于煤粉過量產(chǎn)生了抑制作用，使得實驗組產(chǎn)氣量低于對照組產(chǎn)氣量，這種抑制作用同樣出現(xiàn)在其他學(xué)者的研究[11，27]中。

由圖2c可以看出，煤粉量梯度實驗第一產(chǎn)氣階段持續(xù)了40 d，比文獻(xiàn)[29，31，32]報道的時間長，這是由于0.1%YE培養(yǎng)基所含的有機(jī)營養(yǎng)成分少，對微生物的刺激作用減弱?？焖佼a(chǎn)氣階段主要在第40天～第80天。煤粉量梯度實驗H2體積分?jǐn)?shù)見圖3。由圖3可知，在整個實驗周期內(nèi)，H2體積分?jǐn)?shù)一直維持在很低的水平，在第40天～第80天有微弱增加，表明此階段H2的生成量大于消耗量，H2

圖3 煤粉量梯度實驗H2體積分?jǐn)?shù)Fig.3 Volume fraction of hydrogen of gradient experiment of coal consumption

相對富余，對應(yīng)快速產(chǎn)氣階段，說明H2在產(chǎn)甲烷過程中起重要作用，產(chǎn)甲烷過程需要較高的氫分壓[16]。圖4所示為0.25 g煤實驗組CH4和CO2的體積分?jǐn)?shù)。由圖4可知，在第40天～第80天CO2含量降低，說明CO2被利用。80 d之后H2含量下降，CO2含量上升，對應(yīng)產(chǎn)氣的穩(wěn)定期，說明此階段H2的生成量不足，利用CO2產(chǎn)甲烷的過程趨于結(jié)束。事實上，從煤的元素組成來看，其氫碳物質(zhì)的量比遠(yuǎn)低于形成甲烷氣體所需的4∶1，氫元素是生物甲烷生產(chǎn)過程中的重要限制因素，因此，有學(xué)者[17，27]通過向煤中添加富氫的生物質(zhì)來提高生物甲烷產(chǎn)量。由圖4還可知，CH4和CO2含量未呈現(xiàn)出同步變化的規(guī)律?，F(xiàn)有的理論認(rèn)為，產(chǎn)甲烷的甲基營養(yǎng)型途徑只在鹽湖等特定的生態(tài)環(huán)境中才考慮其影響[16]，乙酸發(fā)酵途徑使CH4和CO2含量的變化出現(xiàn)同步規(guī)律，結(jié)合H2對產(chǎn)甲烷的影響及CH4和CO2含量變化規(guī)律可知，本次產(chǎn)氣呈現(xiàn)CO2還原途徑特征。

圖4 0.25 g煤實驗組CH4和CO2的體積分?jǐn)?shù)Fig.4 Volume fractions of CH4 and CO2in group 0.25 g coal

由圖2c還可知，6.25 g煤的實驗組在整個實驗周期內(nèi)均未出現(xiàn)快速產(chǎn)氣階段，在經(jīng)歷了第一產(chǎn)氣階段后，累計產(chǎn)氣量迅速被其他實驗組及對照組超越，煤粉量顯示出明顯的產(chǎn)甲烷抑制作用。0.01 g煤、0.05 g煤、0.25 g煤、1.25 g煤的實驗組累計產(chǎn)甲烷量均高于對照組及6.25 g煤的實驗組累計產(chǎn)甲烷量，在第120天時約為0.16 mmol。這些實驗組的產(chǎn)氣量趨于一致，并沒有隨著煤粉量的增加而增加，可能與嗜甲烷菌等其他微生物的作用有關(guān)，但其機(jī)理還有待深入研究。實驗組產(chǎn)氣量減去對照組產(chǎn)氣量后除以煤粉量為產(chǎn)甲烷效率，0.01 g煤、0.05 g煤、0.25 g煤、1.25 g煤和6.25 g煤的實驗組產(chǎn)甲烷效率分別為3.12 mmol/g，0.60 mmol/g，0.14 mmol/g，0.02 mmol/g和-0.01 mmol/g，增加底物煤粉量并未提高產(chǎn)氣效率，有研究認(rèn)為這是由于煤粉顆粒產(chǎn)生堆積，有效參與傳質(zhì)的比表面積并未增加[18]。事實上，當(dāng)煤粉超過一定量后，不僅有效傳質(zhì)比表面積未增加，反而產(chǎn)生了抑制作用[27]，導(dǎo)致產(chǎn)甲烷效率出現(xiàn)負(fù)值。

厭氧消化抑制因素研究表明，氨抑制的產(chǎn)生是由于底物蛋白含量高[19，22]，酸抑制的產(chǎn)生是由于揮發(fā)性脂肪酸(VFA)累積[24，26]，對煤制生物甲烷而言，作為底物的煤其結(jié)構(gòu)本身不具備蛋白含量高的特點(diǎn)，且發(fā)酵過程中的VFA作為產(chǎn)甲烷的前體物質(zhì)其含量很低[6，29]，因此，氨抑制與酸抑制均不會出現(xiàn)在煤制生物甲烷過程中。重金屬既可以導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)和功能的破壞，又是酶的組成成分[21]，其對產(chǎn)甲烷菌毒性由大到小的順序為Cu，Zn，Cr，Cd，Ni，Pb[21，33]。煤中的重金屬含量低[34]，為激活產(chǎn)甲烷菌群的活性往往需要向培養(yǎng)基中額外添加重金屬作為微量元素液[35]，而本實驗所用培養(yǎng)基中并未添加重金屬，因此排除了重金屬的毒性抑制作用。

圖5所示為煤粉量梯度實驗不同時間發(fā)酵液的LC-MS譜。實驗啟動時(見圖5a)，實驗組的色譜與對照組的色譜相似，質(zhì)荷比(m/e)為130.1的物質(zhì)含量很低，在液相色譜質(zhì)譜上未出峰。第40天時(見圖5b)，0 g煤、0.01 g煤、0.05 g煤、0.25 g煤、1.25 g煤、6.25 g煤的實驗組發(fā)酵液中m/e為130.1的物質(zhì)含量之比約為2∶2∶1∶1∶1∶1，說明該物質(zhì)是發(fā)酵過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。第80天時(見圖5c)，以上各實驗組發(fā)酵液中m/e為130.1的物質(zhì)含量之比約為1∶1∶2∶1∶1∶1，與第40天時相比發(fā)生了變化，說明該物質(zhì)在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化規(guī)律。第120天時(見圖5d)，以上各實驗組發(fā)酵液中m/e為130.1的物質(zhì)含量之比約為1∶4∶6∶5∶1∶9，除了含煤1.25 g實驗組之外，大體呈現(xiàn)出底物中煤粉量越多，發(fā)酵液中m/e為130.1的物質(zhì)含量越高的趨勢，但并未呈現(xiàn)明顯的比例關(guān)系。結(jié)合累計產(chǎn)甲烷量可知，6.25 g煤實驗組m/e為130.1的物質(zhì)含量最高，相應(yīng)的產(chǎn)甲烷量最少，0.01 g煤、 0.05 g煤、 0.25 g煤的實驗組m/e為130.1的物質(zhì)含量相當(dāng)，最終累計產(chǎn)甲烷量基本相等，說明m/e為130.1的物質(zhì)對產(chǎn)甲烷過程有抑制作用。

圖5 煤粉量梯度實驗不同時間發(fā)酵液的LC-MS譜Fig.5 LC-MS chromatograms of fermentation liquor during different periods of gradient experiment of coal consumptiona—Day 0；b—Day 40；c—Day 80；d—Day 120

2.2 煤中甲醇萃取物產(chǎn)甲烷實驗

圖6所示為煤的甲醇萃取物色譜和累計產(chǎn)氣量。由圖6可知，m/e為130.1的物質(zhì)為煤的甲醇萃取物主要成分之一。對照組產(chǎn)甲烷量為1.73 mmol，實驗組產(chǎn)甲烷量僅為0.03 mmol，與對照組相比，實驗組底物中包含煤的甲醇萃取成分即m/e為130.1的物質(zhì)，這種成分對產(chǎn)甲烷產(chǎn)生了明顯的抑制作用，與前文所述m/e為130.1的物質(zhì)對產(chǎn)甲烷過程有抑制作用結(jié)論一致，經(jīng)過MassHunter Workstation軟件分析，其分子式可能為C6H11NO2，具體的結(jié)構(gòu)式還有待深入研究。

圖6 煤的甲醇萃取物色譜和累計產(chǎn)氣量Fig.6 LC chromatogram and cumulative methane production of methanol extract of coal

值得注意的是，本研究出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象并沒有出現(xiàn)在所有的研究中，有的研究顯示產(chǎn)甲烷量與煤粉量呈現(xiàn)正相關(guān)[36]，這可能與實驗所用的菌源相關(guān)；有的研究認(rèn)為經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)氣后，群落多樣性降低[27]，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化[37]。本研究產(chǎn)甲烷抑制現(xiàn)象的產(chǎn)生，可能與某些能降解抑制物的微生物的缺失有很大關(guān)系，但還需要進(jìn)一步的研究證實。

3 結(jié) 論

1) 本研究產(chǎn)甲烷實驗中CH4和CO2的含量未顯示出協(xié)同變化的規(guī)律，產(chǎn)氣呈現(xiàn)CO2還原途徑特征，產(chǎn)甲烷過程需要較高的氫分壓。煤粉過量(100 mL發(fā)酵液中加入12.5 g煤粉)時顯示出明顯的產(chǎn)甲烷抑制作用，說明微生物在利用煤產(chǎn)氣的代謝過程中會產(chǎn)生對產(chǎn)氣有抑制作用的物質(zhì)，單純增加底物煤粉量并未提高產(chǎn)甲烷效率。

2) 過量的煤粉使發(fā)酵液中的質(zhì)荷比為130.1的物質(zhì)含量增加，對產(chǎn)甲烷過程產(chǎn)生了抑制作用，導(dǎo)致產(chǎn)氣量下降，抑制物的分子式可能為C6H11NO2，具體的結(jié)構(gòu)式還有待深入研究。