向珈誼， 張會芳， 梁露群， 周星丞， 王 丹， 毛彥穩(wěn)， 張小歡， 王圓圓， 郭 兵

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿?。╠iabetic mellitus，DM）嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致慢性腎衰竭的重要原因。在DKD 進(jìn)展至慢性腎衰竭的過程中，表現(xiàn)出腎小球?yàn)V過率下降，尿白蛋白排泄率增加，系膜細(xì)胞增生，腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化［1］，其中代謝紊亂在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。除典型糖代謝紊亂外，脂代謝紊亂也影響著腎纖維化的進(jìn)展［2］。導(dǎo)致腎纖維化的機(jī)制是復(fù)雜的，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腎臟近端小管細(xì)胞的凋亡、肌成纖維細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成等［3］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是高度保守的非編碼小RNA，通過與靶轉(zhuǎn)錄物上的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平，這使得miRNAs成為許多細(xì)胞過程的重要調(diào)節(jié)因子，如能量穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝和胰腺細(xì)胞發(fā)育，脂肪生成等。近年來，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究均表明miRNAs 在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-21 通過促進(jìn)脂蛋白的形成參與冠狀動脈的粥樣硬化過程［5］。在腎臟中的過度表達(dá)miR-21 會導(dǎo)致大鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生［6］。提示miR-21 的失調(diào)可能通過影響代謝途徑參與DKD 的發(fā)生發(fā)展。作為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome prolifer ator-activated receptors-α，PPAR-α），對氧化應(yīng)激、抗炎和減緩凋亡發(fā)展等具有重要的調(diào)控作用。特異性PPAR-α 激動劑非諾貝特已被用于臨床治療減少脂毒性介導(dǎo)的細(xì)胞損傷［7］，我們前期研究表明miR-21 可以促進(jìn)糖尿病腎病的進(jìn)展［6］，但miR-21 是否作用于PPAR-α 影響脂質(zhì)代謝紊亂，并且是否與DKD 的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，目前并不清楚。因此，本研究旨在探索在DKD 大鼠病程發(fā)展中miR-21及PPAR-α的表達(dá)變化與腎纖維化的可能關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞

6 周齡清潔級雄性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量（180±20）g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2015-0001；大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E 購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2 購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM 正常糖培養(yǎng)液（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、DMEM 高糖培養(yǎng)液（葡萄糖濃度為30.0 mmol/L）和胰蛋白酶購自Gibco；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Ⅰ抗稀釋液和超敏ECL 化學(xué)發(fā)光顯示劑（Beyotime）；過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）為Boster 產(chǎn)品；0.45 μm PVDF膜（Millipore）；Tween-20（Solarbio）；iQTM SYBR～Green Supermix（Bio-Rad）；Lipofectamine 2000（Thermo）；miR-21 inhibitor 和miR-21 mimics（RiboBio）；非諾貝特（ApexBio）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和β-actin 抗體（Solarbio）；轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和PPAR-α 抗體（Abcam）；纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和Bax 抗體為Proteintech 產(chǎn)品；IL-18 ELISA 試劑盒（Elabscience）；Annexin V-EGFP 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（KeyGEN）；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Beyotime）。

3 主要方法

3.1 糖尿病大鼠模型的復(fù)制和分組 將12只SD大鼠隨機(jī)分為DM 組和正常對照（normal control，NC）組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，DM 組大鼠進(jìn)行模型復(fù)制：乙醚麻醉后通過尾靜脈給大鼠注射55 mg/kg 的STZ（STZ 用0.01 mmol/L、pH 為4.5 的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解），72 h 后測尾靜脈空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，持續(xù)3 d 即為造模成功［1］。各組大鼠予普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，自由飲水，于成模10 周末處死。

3.2 收集大鼠尿、血和腎組織樣本 成模10 周末收集大鼠24 h尿液并記錄尿量；通過股動脈取血，靜置后離心取血清，置于-80 ℃保存；取雙側(cè)腎臟，去除包膜及脂肪。用40 g/L 的多聚甲醛溶液將一側(cè)腎臟固定，剩余的腎臟保存在-80 ℃。

3.3 生化檢測 大鼠血糖用葡萄糖氧化酶法檢測，血總膽固醇和甘油三酯用酶分析法檢測，尿蛋白濃度用雙縮脲法檢測，具體操作步驟按試劑盒進(jìn)行，其中24 h尿蛋白量=尿蛋白濃度×24 h尿量。

3.4 腎組織形態(tài)學(xué)的觀察 用4%中性甲醛固定的腎臟組織制作成厚度約3 μm 的石蠟切片，用于HE和天狼星紅染色，鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和纖維化病變的情況。天狼星紅染色后膠原纖維呈紅色，200 倍鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)帶腎小球的視野用Image J分析軟件測量膠原紅色陽性染色面積占組織總面積的百分比，即膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF），取其平均值作為該腎組織的CVF。

3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E 在37 ℃及5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合度達(dá)80%時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，1 mL 無菌PBS 洗滌3 次，棄上清液并吸干，加入1 mL胰蛋白酶（濃度為0.25%，37 ℃預(yù)熱）進(jìn)行消化，細(xì)胞懸液均勻鋪于6 孔板中。隨機(jī)將細(xì)胞分為正常糖（normal glucose，NG）組、高糖組（high glucose，HG）組、空載體組（HG+vehicle）組、miR-21 抑制劑組（HG+miR-21 inhibitor 組），正常糖濃度為5.5 mmol/L葡萄糖，高糖濃度為30 mmol/L 葡萄糖；各組細(xì)胞于培養(yǎng)箱中孵育過夜；待細(xì)胞融合至50%～60%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染液配制：Lipofectamine 2000 和miR-21 inhibitor 各7.5 μL，再加入DMEM 培養(yǎng)液（不含血清及雙抗）285 μL 混勻、瞬離，在室溫下于無菌環(huán)境靜置10 min，最后加入DMEM 培養(yǎng)液2.7 mL 混勻?yàn)榭傮w系3 mL 轉(zhuǎn)染液；棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入已經(jīng)混勻好的轉(zhuǎn)染液，輕晃搖勻，繼續(xù)于培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中孵育48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

3.6 Western blot 檢測目的蛋白 稱取約60～100 mg 腎皮質(zhì)置于冰預(yù)冷的勻漿器內(nèi)，加入0.5～1 mL蛋白裂解液充分裂解后冰上研磨。超聲擊打組織液，1 616×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的EP管中；各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，加入細(xì)胞裂解液后刮取細(xì)胞提取總蛋白。BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入1.5×上樣緩沖液配制成統(tǒng)一濃度的蛋白樣品，100 ℃煮沸10 min。蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，TBST洗膜，分別加入PPAR-α（1∶1 000）、Bax（1∶5 000）、IL-6（1∶2 000）、TGF-β1（1∶1 000）、α-SMA（1∶200）、βactin（1∶10 000）和FN（1∶1 000）的Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，TBS 洗膜后加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次后ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc，Bio-Rad）掃描條帶并分析結(jié)果。

3.7 ELISA 檢測IL-18 水平 IL-18 試劑盒購自Elabscience，產(chǎn)品型號為E-EL-R0567c，操作步驟完全按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.8 Real-time PCR 方法檢測miR-21 和PPAR-α mRNA 表達(dá) 采用Trizol 法分離純化各組組織的總RNA，分光光度法測定計(jì)算提取的總RNA 含量及濃度。由RiboBio 公司設(shè)計(jì)并合成miR-21 引物，并用RiboBio 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，步驟及反應(yīng)體系配制均按照說明書進(jìn)行。擴(kuò)增條件為：50°C 30 min；95°C 10 min；95 °C 2 s，60 °C 20 s，70 °C 10 s，40 個(gè)循環(huán)，70°C 10 min。Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測，分別以U6 和GADPH 為內(nèi)參照，目的基因的相對含量以2－ΔΔCt表示，引物序列和退火溫度見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. Sequences of the primers used in real-time PCR

3.9 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-21 對PPAR-α 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用 TargetScan 預(yù)測miR-21和PPAR-α 的3’UTR 區(qū)可能結(jié)合位點(diǎn)，合成包含PPAR-α 的野生型（WT-PPAR-α）或突變體（MUTPPAR-α）種子區(qū)的序列，并將其克隆到螢光素酶和海腎螢光素酶質(zhì)粒中。HK-2 細(xì)胞予DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至50%～60%，分別將WT-PPAR-α、MUT-PPARα 與miR-NC、miR-21 mimics 共轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照螢光素酶活性檢測試劑盒，使用多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific VarioskanTMLUX）先后測定螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的螢光數(shù)值，用海腎螢光素酶螢光強(qiáng)度作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)化后，統(tǒng)計(jì)比值數(shù)據(jù)、作圖。

3.10 流式細(xì)胞儀分析NRK-52E 予非諾貝特刺激后的細(xì)胞凋亡水平 將稀釋后的NRK-52E細(xì)胞懸液均勻鋪于6 孔板中，隨機(jī)將細(xì)胞分為NG 組、HG 組、溶劑對照組（HG+DMSO 組）和非諾貝特組（HG+Fenofibrate 組），細(xì)胞生長至60%融合時(shí)，棄上清，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以終濃度為10 mg/L 的非諾貝特刺激48h，棄上清，PBS 洗1 次，無EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，加入1 mL 含2%BSA 的PBS 終止消化后，用PBS 洗2 次后收集細(xì)胞，加入試劑盒配備的試劑懸浮細(xì)胞后，分別加入Annexin V-EGFP，Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min 進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測細(xì)胞凋亡水平（試劑用量按試劑說明書進(jìn)行）并計(jì)算各組凋亡率。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，各組數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 26.0 分析后，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 一般情況與相關(guān)生化指標(biāo)改變

造模第1 周，大鼠血糖逐漸升高，部分大鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第2 周時(shí)，全部模型組大鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第10 周時(shí)，NC 組大鼠毛發(fā)光亮，飲食飲水正常，與NC 組比較，DM 組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、尿量增多。與NC 組相比，DM 組大鼠血糖、24 h 尿蛋白、總膽固醇和甘油三酯均有顯著增高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠部分血液生化指標(biāo)比較Table 2. Comparison of renal function indexes and biochemical indexes in each group（Mean±SD.n=6）

2 HE和天狼星紅染色觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變

HE染色顯示，NC組腎小球固有細(xì)胞未見顯著增生，基底膜未見顯著增厚，系膜區(qū)未見顯著增寬，腎小管未見顯著萎縮，上皮細(xì)胞未見顯著變性，管腔內(nèi)未見顯著管型，腎間質(zhì)及血管未見顯著病變；DM 組部分腎小球囊腔稍擴(kuò)張，系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度增生，基底膜未見顯著增厚，腎小管局灶節(jié)段性萎縮（萎縮面積小于10%），部分小管上皮顆粒變性，未見明顯管型，腎間質(zhì)小灶性淋巴細(xì)胞浸潤。小血管壁未見顯著增厚。腎臟組織天狼星紅染色顯示，NC 組腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，腎間質(zhì)陽性染色（紅色）少；與NC組比較，DM 組腎臟組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，腎小球和腎小管有顯著陽性染色，CVF升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Histological change of kidneys in each group. A：representative images of HE staining and Sirius red staining（scale bar=50 μm）；B：collagen volume fraction（CVF）was detected. Mean±SD.n=6.*P＜0.05.圖1 各組腎組織形態(tài)學(xué)變化

3 miR-21和PPAR-α mRNA 在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

與NC 組相比，DM 組大鼠腎組織中miR-21 顯著增多（P＜0.05）；PPAR-α mRNA 在DM 組中的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. The levels of miR-21（A）and PPAR-α mRNA（B）in kidney tissues from NC group and DM group. Mean±SD.n=6.*P＜0.05.圖2 miR-21和PPAR-α mRNA在NC及DM大鼠腎組織中的表達(dá)

4 PPAR-α、FN、α-SMA、TGF-β1、IL-6、Bax 和IL-18蛋白在腎組織中的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，PPAR-α 蛋白在NC 組大鼠腎皮質(zhì)呈高表達(dá)，在DM 組表達(dá)較NC 組顯著減少（P＜0.05）。與NC 組相比，DM 組大鼠腎組織中FN、α-SMA、TGF-β1、IL-6 和Bax 蛋白表達(dá)增多（P＜0.05），見圖3A；ELISA 檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組IL-18的含量升高（P＜0.05），見圖3B。

Figure 3. Relative protein expression of PPAR-α，F(xiàn)N，α-SMA，TGF-β1，IL-6，Bax and IL-18 in renal tissues of each group. A：the protein levels of PPAR-α，F(xiàn)N，α-SMA，TGF-β1，IL-6 and Bax in renal tissues were detected by Western blot；B：the expression of IL-18 in renal tissues was detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P＜0.05.圖3 PPAR-α、FN、α-SMA、TGF-β1、IL-6、Bax和IL-18蛋白在各組腎組織的表達(dá)

5 miR-21靶向抑制PPAR-α表達(dá)

通過TargetScan 預(yù)測，分別構(gòu)建含有野生型PPAR-α 3'-UTR 和突變型PPAR-α 3'-UTR 序列的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（圖4A）。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HK-2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型載體WTPPAR-α的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-21組螢光素酶活性顯著低于miR-NC 組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染突變型載體MUTPPAR-α的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-21 組螢光素酶活性與miR-NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4B。Western blot 結(jié)果顯示，在HK-2 細(xì)胞過表達(dá)miR-21 后，PPAR-α 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖4C。

Figure 4. PPAR-α expression was inhibited by miR-21. A：bioinformatics website TargetScan predicts that miR-21 may regulate thePPAR-α gene；B：PPAR-α luciferase activity detection results；C：down-regulation of PPAR-α protein level after miR-21 mimics transfection. Mean±SD.n=3.*P＜0.05.圖4 miR-21靶向抑制PPAR-α表達(dá)

6 miR-21 抑制劑減輕高糖條件下大鼠腎小管上皮細(xì)胞的損傷

Western blot 結(jié)果顯示，與NG 組相比，高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞后PPAR-α 蛋白表達(dá)顯著下降，F(xiàn)N、IL-6 和Bax 蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）；在HG處理并轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，NRK-52E中PPARα 蛋白表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)N、IL-6 和Bax 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. miR-21 inhibitor attenuated hyperglycemia-induced NRK-52E cell damage. Mean±SD.n=3.*P＜0.05；#P＜0.05.圖5 miR-21抑制劑減輕高糖條件下大鼠腎小管上皮細(xì)胞的損傷

7 非諾貝特抑制高糖對大鼠腎小管上皮細(xì)胞的損傷

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NG組［（4.34±0.27）%］相比，HG 刺激后細(xì)胞凋亡率［（15.29±3.07）%］顯著增高；與溶劑對照組［（14.88±4.04）%］相比，在給予PPAR-α 特異性激動劑非諾貝特后，其細(xì)胞凋亡率［（7.17±0.61）%］減少（P＜0.05），見圖6A；Western blot 結(jié)果顯示，與NG 組相比，高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞后PPAR-α蛋白表達(dá)顯著下降，F(xiàn)N 和IL-6 蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）；在HG處理并給予非諾貝特后，NRK-52E細(xì)胞PPAR-α 蛋白表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)N 和IL-6 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖6B。

Figure 6. Fenofibrate inhibited the damage of renal tubular epithelial cells induced by high glucose. A：flow cytometry results of NRK-52E cells in each group；B：Western blot results of PPAR-α，F(xiàn)N and IL-6 expression. Mean±SD.n=3.*P＜0.05；#P＜0.05.圖6 非諾貝特抑制高糖對大鼠腎小管上皮細(xì)胞的損傷

討論

DKD 是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為終末期腎病的首要病因，其主要病理改變特點(diǎn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，常表現(xiàn)為上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitio，EMT）發(fā)生和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積［8］。代謝紊亂在DKD 病程的發(fā)展中有著重要的作用，長期的高血糖會引起脂蛋白脂肪酶的功能降低，導(dǎo)致甘油三酯水平升高，高密度脂蛋白膽固醇下降等血脂改變［9］。本研究結(jié)果顯示，與NC 組相比較，DM 組大鼠10 周末血糖、24 h 尿蛋白、總膽固醇與甘油三酯均顯著增高，生化指標(biāo)結(jié)果表明DM組大鼠已發(fā)生糖、脂代謝紊亂；同時(shí)腎臟切片顯示，腎小管管腔增大，膠原纖維沉積，明確腎臟形態(tài)已經(jīng)發(fā)生異常病理改變；與NC組相比，DM組中α-SMA、FN和TGFβ1 的表達(dá)增加；結(jié)合生化指標(biāo)與病理形態(tài)學(xué)，說明DM大鼠腎臟發(fā)生了EMT及纖維化病變。

目前研究表明，多種miRNAs在腎細(xì)胞中有功能表達(dá)，并且在腎臟生理功能調(diào)節(jié)和腎臟相關(guān)疾病如糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，如miR-21、miR-377 和miR-93 等［10］。其中，miR-21 可通過調(diào)控下游PTEN/AKT、TGF-β1/smad3 等幾種主要的信號通路影響DKD 的發(fā)生發(fā)展［11］。課題組前期研究結(jié)果顯示miR-21 在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6］，本研究結(jié)果與前述文獻(xiàn)結(jié)果［6，11］一致。在本研究中，糖尿病大鼠腎組織中miR-21 表達(dá)水平顯著升高、α-SMA、TGF-β1 和FN 蛋白表達(dá)增多；高糖培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞中抑制miR-21可降低FN 蛋白表達(dá)減緩纖維化的發(fā)展。這些結(jié)果均證實(shí)miR-21參與DKD 的發(fā)生發(fā)展，而抑制miR-21可延緩腎臟纖維化。

Ni等［12］在人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-21后，觀察到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的含量顯著增加，并且脂肪酸合酶，乙酰輔酶A羧化酶1等關(guān)鍵脂質(zhì)代謝酶的水平顯著提高。PPAR-α 是過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome prolifer ator-activated receptors，PPARs）中一個(gè)重要亞型，在腎臟、肝臟和心臟等臟器中呈高度表達(dá)［13］。作為脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，PPAR-α 能夠激活過氧化物酶體、線粒體基質(zhì)中涉及脂肪酸氧化的多個(gè)基因參與維持正常的脂質(zhì)代謝。因PPAR-α是與脂質(zhì)代謝關(guān)系非常密切的基因，為了進(jìn)一步闡明miR-21 參與脂質(zhì)代謝紊亂調(diào)節(jié)糖尿病腎病大鼠的機(jī)制，我們采用real-time PCR 方法研究DM 組大鼠體內(nèi)miR-21 與PPAR-α mRNA 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與NC 組相比，DM 組腎組織miR-21 表達(dá)較NC 組顯著性增高，而PPAR-α mRNA 和蛋白的表達(dá)則顯著降低。并且在高糖條件下培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，給予miR-21 inhibitor能逆轉(zhuǎn)高糖對PPAR-α 的抑制效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)提示miR-21 可調(diào)控PPAR-α基因表達(dá)。我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan 分析預(yù)測miR-21 的種子序列（5'-AGCUUA-'3）與人PPAR-α mRNA 的3'UTR 序列（5'-UAAGCU-3'）互補(bǔ)。體外螢光素酶檢測結(jié)果顯示miR-21 mimics 可顯著抑制PPAR-α 的轉(zhuǎn)錄活化，若突變PPAR-α 3'UTR 結(jié)合區(qū)域，可消除該效應(yīng)；并且，給予miR-21 mimics 可下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞PPAR-α蛋白水平，提示miR-21能夠靶向抑制PPARα 表達(dá)。因此，我們推測miR-21 通過抑制靶基因PPAR-α表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)作用。

在單側(cè)輸尿管梗阻的模型中，上調(diào)PPAR-α可顯著抑制促炎細(xì)胞因子/趨化因子IL-6，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的mRNA 表達(dá)［14］。在肝癌細(xì)胞中，PPAR-α 還抑制炎癥因子IL-18 的表達(dá)［15］。IL-6 和IL-18 作為重要的促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)其他炎癥因子釋放，使血管通透性增加，致使腎小球基底膜損傷進(jìn)而導(dǎo)致腎臟的損傷以及纖維化［16］。有文獻(xiàn)報(bào)道，上調(diào)PPAR-α的表達(dá)可減弱凋亡源性因子如Bax 、caspase 的水平［17］。Tanaka 等［18］研究結(jié)果顯示，PPAR-α 特異性激動劑非諾貝特可減輕高脂導(dǎo)致的腎小球損傷和腎小管間質(zhì)的損傷，增加脂肪分解酶的表達(dá)，加強(qiáng)腎臟的脂解作用，減弱腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)與炎癥反應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在DM組腎組織中炎癥因子IL-6和IL-18及凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平較NC 組顯著升高。體外實(shí)驗(yàn)中，與NG 組相比，在HG環(huán)境中，IL-6、Bax和FN蛋白表達(dá)顯著升高，抑制miR-21 后上述效應(yīng)反轉(zhuǎn)；給予PPAR-α 激動劑非諾貝特后，不僅顯著降低細(xì)胞凋亡率，并且可減少HG 誘導(dǎo)的IL-6 和FN 蛋白表達(dá)。這與抑制miR-21 的效應(yīng)相同，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為miR-21可下調(diào)脂代謝關(guān)鍵因子PPAR-α促進(jìn)細(xì)胞炎癥與凋亡反應(yīng)，這可能是miR-21導(dǎo)致DKD進(jìn)展的重要機(jī)制之一。

綜上所述，高糖可通過上調(diào)miR-21 抑制PPARα 表達(dá)，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡，參與糖尿病大鼠腎臟組織EMT的發(fā)生和ECM 沉積，最終影響其腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究闡釋。